金属硫蛋白的检测方法
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解决时间 2021-02-17 21:49
- 提问者网友：太高姿态
- 2021-02-17 04:35
金属硫蛋白的检测方法
最佳答案
- 五星知识达人网友：長槍戰八方
- 2021-02-17 05:31
随着对MT研究的进一步深入，建立的MT检测方法较多，但所有这些方法都是建立在MT的理化特性和生物特性以及免疫学特性基础上，主要分以下几大类。 此方法主要是利用巯基（-SH）在汞滴表面产生氧化还原出现的电位变化建立的，以测定巯基来计算MT的含量，是一种可以直接用于测定MT总量的方法，具有一定的特异性。其检测限可达ng/ml水平。
运用检测MT的电化学方法有：示差脉冲极谱法（DPP）、微分脉冲极谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）和循环伏安法（CV）等。Bordin等通过改变检测体系的pH值，利用DPP可以很方便地检测出样品中多种形式的MT，同时能快捷地分析出还原型的MT。 此类方法主要是通过蛋白质含量测定来计算MT浓度，免疫法是最主要的方法。它尤其适合于微量检测，具有灵敏、特异的特点，灵敏度在pg/ml级，对存在体液中含量甚微的MT具有较好的检测效果。在近些年，先后建立了Western Blotting法、放射性免疫检测法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。
RIA法首先由Mallie等在1979年检测大鼠血清中MT的含量时建立的，随后Mulder等建立了测定人体液中MT含量的RIA，Zahir Shaidh A等报道了用RIA检测镉污染地区人群的尿液MT含量。此方法的检测范围在0.1～100ng/ml之间，但是此方法要用放射性同位素，需要3天左右的时间，给检测带来不便。
1986年Thomas等建立了ELISA法，与RIA法无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相比具有测定相对迅速，且不需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。Akintola等在1995年利用MT-1制备抗体建立了ELISA测定人血浆和尿液中的MT含量，检测限可达5ng/ml。郑军恒等在检测人血液中的MT过程中建立了2种ELISA方法，直接型ELISA的检测范围为1～10ng，可用于检测较纯样品，竞争性ELISA较好的检测范围是50～500ng，用于检测较粗的样品中MT的含量。 采用液相色谱（LC）和紫外（UV）相结合检测确定家兔肝脏中分离脱金属硫蛋白的最佳条件，同时，利用LC-ES-MS可以确定家兔肝脏中不同结构的脱金属硫蛋白，主要对MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的结构及其同分异构体进行了研究。
由于目前金属硫蛋白的测定主要采用紫外-可见分光光度法以及原子吸收光谱法测定其中的金属离子。前一种方法灵敏度较低，由于检测取样少，检测过程中造成的误差较大，后一种方法却因为分离纯化过程中可能有部分金属脱离蛋白造成损失引起误差，且测定费用昂贵。针对这种情况，建立了镉金属硫蛋白的非原子化测定方法，检出限与石墨炉法（GFAAS）相近。 随着分子生物学技术的快速发展，使MT克隆技术、RNA印迹技术和PCR技术应用于MT的定量检测成为现实。MT克隆检测是通过MT多克隆和单克隆抗体，运用免疫扩散、免疫电泳等方法来检测组织中的MT-mRNA含量进行定量分析，这在MT分子的生物学研究中有很重要的意义。
MT多采用联机检测，虽然以免疫法最为可靠，但是检测过程复杂，时间消耗大，联机检测大大节省了时间，同时可以减少检测过程中产生的误差。MT在逐步产业化，然而目前还缺乏一种简便、灵敏、快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术，这也成为MT研究的热点。
运用检测MT的电化学方法有：示差脉冲极谱法（DPP）、微分脉冲极谱法、示差脉冲阳极溶出伏安法（DPASV）和循环伏安法（CV）等。Bordin等通过改变检测体系的pH值，利用DPP可以很方便地检测出样品中多种形式的MT，同时能快捷地分析出还原型的MT。 此类方法主要是通过蛋白质含量测定来计算MT浓度，免疫法是最主要的方法。它尤其适合于微量检测，具有灵敏、特异的特点，灵敏度在pg/ml级，对存在体液中含量甚微的MT具有较好的检测效果。在近些年，先后建立了Western Blotting法、放射性免疫检测法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）。
RIA法首先由Mallie等在1979年检测大鼠血清中MT的含量时建立的，随后Mulder等建立了测定人体液中MT含量的RIA，Zahir Shaidh A等报道了用RIA检测镉污染地区人群的尿液MT含量。此方法的检测范围在0.1～100ng/ml之间，但是此方法要用放射性同位素，需要3天左右的时间，给检测带来不便。
1986年Thomas等建立了ELISA法，与RIA法无显著差异，灵敏度可达100pg/ml，与RIA相比具有测定相对迅速，且不需昂贵的仪器设备和接触放射性同位素。Akintola等在1995年利用MT-1制备抗体建立了ELISA测定人血浆和尿液中的MT含量，检测限可达5ng/ml。郑军恒等在检测人血液中的MT过程中建立了2种ELISA方法，直接型ELISA的检测范围为1～10ng，可用于检测较纯样品，竞争性ELISA较好的检测范围是50～500ng，用于检测较粗的样品中MT的含量。 采用液相色谱（LC）和紫外（UV）相结合检测确定家兔肝脏中分离脱金属硫蛋白的最佳条件，同时，利用LC-ES-MS可以确定家兔肝脏中不同结构的脱金属硫蛋白，主要对MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的结构及其同分异构体进行了研究。
由于目前金属硫蛋白的测定主要采用紫外-可见分光光度法以及原子吸收光谱法测定其中的金属离子。前一种方法灵敏度较低，由于检测取样少，检测过程中造成的误差较大，后一种方法却因为分离纯化过程中可能有部分金属脱离蛋白造成损失引起误差，且测定费用昂贵。针对这种情况，建立了镉金属硫蛋白的非原子化测定方法，检出限与石墨炉法（GFAAS）相近。 随着分子生物学技术的快速发展，使MT克隆技术、RNA印迹技术和PCR技术应用于MT的定量检测成为现实。MT克隆检测是通过MT多克隆和单克隆抗体，运用免疫扩散、免疫电泳等方法来检测组织中的MT-mRNA含量进行定量分析，这在MT分子的生物学研究中有很重要的意义。
MT多采用联机检测，虽然以免疫法最为可靠，但是检测过程复杂，时间消耗大，联机检测大大节省了时间，同时可以减少检测过程中产生的误差。MT在逐步产业化，然而目前还缺乏一种简便、灵敏、快捷适宜产业化的分离纯化和检测技术，这也成为MT研究的热点。
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