人胚肾细胞衍生株293t细胞有什么特点

人胚肾细胞衍生株293t细胞有什么特点

1. 养293细胞和293T一样。以293T为例，预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD
包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml
Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

7.
取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

9.
转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

12 4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

13 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。

293t细胞的培养 ： 293t细胞是由293 细胞派生, 表达sv40 大t抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。 293t 为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。 培养条件为: 完全培养基: 高糖 dmem, 10% 胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% dmso。 传代方法为: 1．吸掉293t 细胞培养瓶内的培养液; 2．吸取适量的无ca2+ 和mg2+ 的pbs, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍; 3．加少量的0.05% 胰蛋白酶-edta (一般25 cm2 的培养瓶加1 ml, 75 cm2 的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s; 4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液; 5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。值得注意的是, 293t细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。所以, 在更换新鲜培养液或者用pbs冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。 6、传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-edta即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。有些同学反映293t 细胞容易结团不易被吹打开来。如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml 移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 7、加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。一般293t 细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90% 融合, 再以1∶4~1∶8 的比率传代。合适的传代周期为2~3 天。 8、传代过程中, 消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。 完成传代后放入培养箱前： 应该把培养瓶或培养皿沿x、y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。冷冻293t 细胞的冻存液可以用95% 小牛血清加5% 二甲基亚砜, 复苏率很高。 293t细胞的生长状态直接关系到包装病毒和转染的效率, 应尽量选择传代次数少, 培养总时间短的细胞。从细胞形态上看, 相差显微镜下观察立体感强并且形态良好的细胞产病毒率或者转染效率都很高。 虽然293t细胞的应用非常广泛, 几乎每个实验室都有一株自己的293t 细胞株, 但是经常有同学提出: 为什么在正常的培养条件下, 细胞却很难传代下去, 包装病毒效率很低, 对转染效率也不满意呢？ 事实上, 引起类似问题的元凶是一种生物界最小的原核细胞生物－支原体。支原体污染后, 它们不会使细胞死亡而是与细胞长期共存, 培养基不发生浑浊, 细胞无明显变化, 外观上给人以正常感觉, 但事实上细胞正在受到到多方面影响, 如引起细胞变形, 影响dna 合成, 抑制细胞生长等。我们曾经收集到四株分别来自四个不同实验室的293t 细胞, 经检测均为支原体阳性, 令人惊讶的是这四株细胞都已经不是典型的293t 细胞形态, 每两株之间比较竟然形状各不相同, 很难相信这是同一种细胞！这些支原体阳性细胞普遍传代周期长, 显微镜下观察细胞碎片多, 长期支原体感染已经使这些细胞羸弱不堪, 胞内dna 和蛋白质合成受到严重的影响。 因此, 有效地防治支原体污染, 杜绝交叉感染对提高实验效率, 稳定实验结果至关重要。我们的经验是把防治支原体污染作为细胞培养的一项日常工作, 除了对细胞培养设备环境的清洁外, 还需在器材消毒, 操作员培训, 严格把关新引入细胞株的质量等方面做大量细致的工作

如以上回答内容为低俗、色情、不良、暴力、侵权、涉及违法等信息，可以点下面链接进行举报！

点此我要举报以上问答信息