我做引物特异性扩增，引物上的TM值是61.9度，我把退火温度从55度降到51度，隔一度试一次，二聚体还是有呢

答案:3 悬赏:70 手机版

解决时间 2021-11-27 11:32

提问者网友：趣果有间
2021-11-26 23:35

最佳答案

五星知识达人网友：时间的尘埃
2021-11-27 01:07

这个要看你的实验目的了，你可以根据引物设计时给出的退火温度前后各十度做个温度PCR，然后选择能扩出带的温度。如果二聚体对实验影响较大的话则建议你换引物吧。追问请问，您的意思是？在引物设计给出的退火温度基础上，加10度和降10度做PCR吗？我怕的就是55度都没有出条带，那么温度更高了，会不会更没有条带呢？追答对，软件给出的退火温度只能作为一个参考，实际的退火温度我们都是通过温度梯度PCR测出来的，鉴于你的样品在55度未扩增可以退几个温度试试。祝你顺利！

全部回答

1楼网友：孤老序
2021-11-27 02:27

你应该试着把退火温度往上调，55，58，61这样，还有你的目的条带是多少啊？追问我的目标条带是176BP，因为55度没有出条带，但是降低温度之后。54度。53度都有条带了，但是因为有引物二聚体，所以不知道是降低温度好呢，还是升高退火温度好呢，还有其他参数要不要改变？谢谢追答那些条带会不会全是引物二聚体啊？？温度都已经很低了，建议还是试着调高温度做一次吧。176bp，25个循环都已经足够了，除非表达量太低了，或许是引物设计得不太好

2楼网友：风格不统一
2021-11-27 02:06

你的退火温度已经挺低的哦，循环数也不小，如何还扩不出来可能就是表达量太少，不好扩，建议用realtime PCR试试追问可是，做real time PCR 不是也得摸索最佳条件吗？我就是想先摸索好了条件，之后再上荧光定量的

我要举报

如以上回答内容为低俗、色情、不良、暴力、侵权、涉及违法等信息，可以点下面链接进行举报！

点此我要举报以上问答信息