单酶切问题

单酶切问题

首先明确一个问题，你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗，也就是说你只想把这个质粒切开吗？看你的结果好象这种可能性大些，那样我觉得最有可能是梅切不完全，即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近。
建议：首先电泳时要有原质粒作对照，这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了。其次想酶切完全，可延长梅切时间，看你的体系酶的量足够了，而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间。最后若是可以确定两条带中有一条是切开的，则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体，在和目的片段连接，注意这时凝胶回收是必要的，但若两条带太相近，则可能切的时候难分离；若是改变实验条件最终完全梅切（只一条带，且和原质粒位置有差异），则可以用加热65度20分钟的（对于37度酶）方法将酶灭活直接用作连接载体即可，不用回收。
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况，若不是则会切下一小段片段，并且一定要凝胶回收才可得到连接载体。

质粒浓度多高？一般质粒1 ug左右，多了切不动，适当延长酶切时间。还有你酶切位点有几个？如果是单酶切位点的话，应该不会出现这种情况。单酶切的话，可以不用胶回收纯化，双酶切经胶回收除掉小片段后连接效率会更高。

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