小鼠肝细胞结构特征
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解决时间 2021-01-30 22:12
- 提问者网友:蔚蓝的太阳
- 2021-01-30 15:05
小鼠肝细胞结构特征
最佳答案
- 五星知识达人网友:你可爱的野爹
- 2021-01-30 16:24
题干不清
全部回答
- 1楼网友:忘川信使
- 2021-01-30 16:43
小鼠品系:不限
小鼠日龄:6周龄以上适合两步灌流法,6周龄以下适合组织块剪碎法。
两步灌流法:
1.小鼠按80mg/kg的剂量腹腔注射,待小鼠进入深度麻醉状态后迅速将其固定于解剖板上,于超净台中解剖,暴露肝脏。
2.沿门静脉插管固定,灌流前灌流液20ml,流速3-5ml/min。待肝脏完全膨胀,剪断下腔静脉。
3.前灌流液灌流结束后,灌流5ml缓冲液后灌流后灌流液30ml,3-5ml/min。
4.取下肝脏,使用基础培养基冲洗肝脏表面1次。剪碎肝脏,加入20ml基础培养基,轻轻吹打,先后过滤80目、200目细胞筛,收集滤液,600rpm,离心5min。
5.收集沉淀,加入20ml基础培养基重悬细胞,600rpm,离心5min。
6.收集沉淀,加入适量完全培养基+10%fbs重悬细胞,台盼蓝染色计数,以5×105/孔转移细胞入6孔细胞培养板生长。
7.隔天换液,使用完全培养基+5%fbs培养细胞,隔天换液。
组织块剪碎法:
1.断头处死成年小鼠,充分放血后迅速无菌取出肝脏组织,置于缓冲液中;
2.首先将肝组织剪成5mm边长的组织块,使用缓冲液洗涤2-3遍,然后进一步将肝组织剪碎成1mm3的组织小块,使用缓冲液冲洗直至上清澄清;
3.组织块转移至50ml离心管内,加入10ml消化液,37%,静置消化1h,间隔15min摇动1次;
4.消化完全后使用巴氏滴管反复吹打消化产物30次,消化物分别过80目、200目细胞筛,收集滤液;
5.1000rpm,室温离心8min,收集细胞,使用基础培养基重悬细胞;
6.600rpm,离心5min,重复离心纯化2次,细胞经台盼蓝染色,计数,按1x106/25cm2的细胞数分瓶,使用完全培养基+20%fbs进行培养。
7.18h后换液,以后每天换液。
试剂配方:
前灌流液:
含0.02%edta,50u/ml肝素钠的无ca2+,mg2+的hbss
缓冲液:
含ca2+,mg2+的hbss
后灌流液:
含0.1%ⅳ型胶原酶的hbss(含ca2+,mg2+)
基础培养基:
高糖dmem+10%fbs
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