二氰二氨的检测方法
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解决时间 2021-11-08 11:16
- 提问者网友：听门外雪花风
- 2021-11-07 14:09
二氰二氨的检测方法
最佳答案
- 五星知识达人网友：神的生死簿
- 2021-11-07 14:21
北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。 针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。 1实验部分 1.1仪器、试剂与材料 高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。 双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），采用Hypercard色谱柱（3cc，200mg/PN：60106-301）和 HILIC液相色谱柱（SyncronisHILIC PN:97505-102130），微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
表1双氰胺的信息 名称 结构式 分子量 CAS 双氰胺 84.08 461-58-5 1.2实验步骤 称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入Hypercard色谱柱（3cc，200mg/PN：60106-301），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。 注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； 2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。 1.3实验条件 1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： 色谱柱：HILIC液相色谱柱（SyncronisHILIC PN:97505-102130）5μm，2.1*1500mm； 流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85； 波长：220nm；进样量：10µl；柱温：25℃；流速：0.8mL/min。 1.3.2LC-MS/MS法： （1）色谱条件： 色谱柱：HILIC液相色谱柱（SyncronisHILIC PN:97505-102130）5μm，2.1*1500mm； 流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0） B：乙腈； 进样量：10µL；柱温：25℃；流速：0.3 mL/min。
表2流动相梯度程序 时间，min A% B% 0 10 90 0.4 50 50 1.8 50 50 1.9 10 90 7 10 90 （2）质谱条件： 质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。
表3双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/68.1 71 10 41 6 85.1/43.1 71 10 41 6 注：带“____”的监测离子对为定量离子对。
2.结果与讨论
2.1高效液相色谱法： 2.1.1双氰胺的液相色谱图
图1双氰胺1µg/ml标准溶液的液相色谱图
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，结果见表4：
表4双氰胺线性方程和定量限（HPLC法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺 5.57min Y=108.16X+27.827 0.9971 0.5µg/g 2.1.3准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5
表5 0.5µg/g添加回收实验结果（HPLC法） 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.3% 85.5% 89.1% 85.63% 3.97%
图2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图
图3 婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的液相色谱图
2.2LC-MS/MS法 2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图
图4双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图
2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：
表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺 2.25min Y=3859.1X+23694 0.9900 2ng/g 2.2.3准确度和精密度 选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 10ng/g添加回收实验结果 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.5% 83.5% 89.3% 85.2% 4.31% 图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图
图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平的质谱图
表1双氰胺的信息 名称 结构式 分子量 CAS 双氰胺 84.08 461-58-5 1.2实验步骤 称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入Hypercard色谱柱（3cc，200mg/PN：60106-301），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。 注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀； 2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。 1.3实验条件 1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）： 色谱柱：HILIC液相色谱柱（SyncronisHILIC PN:97505-102130）5μm，2.1*1500mm； 流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85； 波长：220nm；进样量：10µl；柱温：25℃；流速：0.8mL/min。 1.3.2LC-MS/MS法： （1）色谱条件： 色谱柱：HILIC液相色谱柱（SyncronisHILIC PN:97505-102130）5μm，2.1*1500mm； 流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0） B：乙腈； 进样量：10µL；柱温：25℃；流速：0.3 mL/min。
表2流动相梯度程序 时间，min A% B% 0 10 90 0.4 50 50 1.8 50 50 1.9 10 90 7 10 90 （2）质谱条件： 质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。
表3双氰胺质谱信息 药物名称 监测离子对 DP EP CE CXP 双氰胺 85.1/68.1 71 10 41 6 85.1/43.1 71 10 41 6 注：带“____”的监测离子对为定量离子对。
2.结果与讨论
2.1高效液相色谱法： 2.1.1双氰胺的液相色谱图
图1双氰胺1µg/ml标准溶液的液相色谱图
2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，结果见表4：
表4双氰胺线性方程和定量限（HPLC法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺 5.57min Y=108.16X+27.827 0.9971 0.5µg/g 2.1.3准确度和精密度 选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5
表5 0.5µg/g添加回收实验结果（HPLC法） 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.3% 85.5% 89.1% 85.63% 3.97%
图2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图
图3 婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的液相色谱图
2.2LC-MS/MS法 2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图
图4双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图
2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限 准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：
表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法） 名称 保留时间 线性方程 相关系数 最低定量限（S/N=10） 双氰胺 2.25min Y=3859.1X+23694 0.9900 2ng/g 2.2.3准确度和精密度 选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。
表7 10ng/g添加回收实验结果 平行1 平行2 平行3 平均值 RSD 82.5% 83.5% 89.3% 85.2% 4.31% 图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图
图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平的质谱图
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