醋酸锂转化法te的ph过高有什么影响
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解决时间 2021-11-07 23:33
- 提问者网友：却不属于对方
- 2021-11-07 10:40
醋酸锂转化法te的ph过高有什么影响
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- 五星知识达人网友：时间的尘埃
- 2021-11-07 11:06
酵母转化试剂盒peg文名意思
1、毕氏酵母氯化锂转化
(1)试剂 1M LiCl(用离蒸馏水配制滤膜滤除菌;必要用消毒离水稀释) 50% PEG3350(Sigma P3640 用离蒸馏水配制滤膜滤除菌用较紧盖瓶装) 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存 注：醋酸锂毕氏酵母效仅氯化锂效;PEG3350屏蔽高浓度LiCl毒害作用;
(2)受态毕氏酵母制备 接种Pachia pastoris50ml YPD培养基30℃摇菌夜(约24～28h)培养OD值0.8～1.0(约108 Cells/ml); 收获细胞用25ml菌水洗涤室温1500g离10min; 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液悬液转入1.5ml离管; 离机速度离15秒沉淀菌体重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液; 按50ul/管装立即进行转化; 注：要受态酵母菌冰浴;
(3)毕氏酵母转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min迅速冰浴制备单链担体DNA; 受态酵母菌离Tips除残余LiCl溶液; 于每转化按顺序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全布均匀(约1min); 30℃水浴孵育30min; 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离收集酵母菌体; 重悬酵母于1ml YPD培养基30℃摇床孵育; 1～4h取25～100ul菌液铺选择性培养基平板于30℃培养2～3鉴定;
2、毕氏酵母PEG1000转化
(1)试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol10mM BicinepH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 缓冲液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)0.2M BicinepH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl10mM BicinepH8.35 未污染新鲜、试剂级DMSO-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜滤-20℃保存; DNA直接加冻结酵母细胞本实验关键处(即使冰解冻待转化细胞其摄取外源DNA能力解冻程迅速降;进行品转化建议按6品/组进行);
(2)待转化毕氏酵母制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基30℃振荡培养夜; 取步骤2量菌液接种100mlYPD培养基振荡培养待其OD值0.1升0.5～0.8; 室温3000g离收集酵母菌体50ml缓冲液A洗涤; 重悬菌体于4ml缓冲液A按0.2ml/管装于1.5ml离管每管加入11ulDMSO混合迅速于液氮冷冻 -70℃保存
(3)毕氏酵母转化 约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水直接加于冻结酵母细胞;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)获转化率; 37℃水浴孵育5min间混合品1～2; 取离管加入1.5ml缓冲液B彻底混匀; 30℃水浴孵育1h; 室温2000g离10min除清液菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C; 离品除清液轻微操作品重悬于0.2ml缓冲液C; 所转化液铺于选择性平板于30℃孵育3～4鉴定;
3、毕氏酵母电转化
(1)E.coli TOP10F’受态细胞制备 取10ul TOP10F’菌液接种于200ml LB液体培养基化培养37℃200 rpm16～18取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基 37℃200 rpm培养16～18 灭菌500 ml离管4℃4000 rpm20 min菌体沉淀弃清菌体用10%甘油重悬并洗涤重复洗涤3 第三离弃绝部清留约1ml 液体用于重悬菌体 制受态细胞取200ul于灭菌EP管加入连接反应产物5ul混匀要产气泡冰放置5min 混匀200ul菌液移入电击杯 使用电击穿孔仪进行转化设置电压 2500 V间 5 ms 电击往电击杯加入 800ul SOC培养基冲洗菌体转移至灭菌1.5 ml EP管37℃150 rpm 轻摇45～60 min 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml LLB-Zeocin平板放待涂布液流37℃ 培养12～16
(2)线性化质粒DNAPichia pastorisGS115转化 取新鲜制备(或-70℃冻存)受态细胞置于冰浴使其完全解冻;
1)100μl菌体移至新菌Eppendorf管加入5-20μg线性化质粒(5～10μl)轻弹混匀尽数吸转移0.2cm型电穿孔转化杯;
2) 转化杯置于冰浴5～10钟保持低温
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V;电阻：400Ω;电容：25μF;脉冲间：10mS;电击
4) 电击马电击转化杯加入1ml 4℃预冷1M山梨醇溶液用微量移液枪吹打均匀置于冰浴; 5) 取30℃烘至表面半干MD培养基平板超净工作台菌操作涂布平板400μl/板
感觉提问主意不是很清晰
建议查下资料哦
1、毕氏酵母氯化锂转化
(1)试剂 1M LiCl(用离蒸馏水配制滤膜滤除菌;必要用消毒离水稀释) 50% PEG3350(Sigma P3640 用离蒸馏水配制滤膜滤除菌用较紧盖瓶装) 2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存 注：醋酸锂毕氏酵母效仅氯化锂效;PEG3350屏蔽高浓度LiCl毒害作用;
(2)受态毕氏酵母制备 接种Pachia pastoris50ml YPD培养基30℃摇菌夜(约24～28h)培养OD值0.8～1.0(约108 Cells/ml); 收获细胞用25ml菌水洗涤室温1500g离10min; 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液悬液转入1.5ml离管; 离机速度离15秒沉淀菌体重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液; 按50ul/管装立即进行转化; 注：要受态酵母菌冰浴;
(3)毕氏酵母转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min迅速冰浴制备单链担体DNA; 受态酵母菌离Tips除残余LiCl溶液; 于每转化按顺序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全布均匀(约1min); 30℃水浴孵育30min; 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离收集酵母菌体; 重悬酵母于1ml YPD培养基30℃摇床孵育; 1～4h取25～100ul菌液铺选择性培养基平板于30℃培养2～3鉴定;
2、毕氏酵母PEG1000转化
(1)试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol10mM BicinepH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol 缓冲液B：40%(w/v)PEG1000(sigma)0.2M BicinepH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl10mM BicinepH8.35 未污染新鲜、试剂级DMSO-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜滤-20℃保存; DNA直接加冻结酵母细胞本实验关键处(即使冰解冻待转化细胞其摄取外源DNA能力解冻程迅速降;进行品转化建议按6品/组进行);
(2)待转化毕氏酵母制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基30℃振荡培养夜; 取步骤2量菌液接种100mlYPD培养基振荡培养待其OD值0.1升0.5～0.8; 室温3000g离收集酵母菌体50ml缓冲液A洗涤; 重悬菌体于4ml缓冲液A按0.2ml/管装于1.5ml离管每管加入11ulDMSO混合迅速于液氮冷冻 -70℃保存
(3)毕氏酵母转化 约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水直接加于冻结酵母细胞;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)获转化率; 37℃水浴孵育5min间混合品1～2; 取离管加入1.5ml缓冲液B彻底混匀; 30℃水浴孵育1h; 室温2000g离10min除清液菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C; 离品除清液轻微操作品重悬于0.2ml缓冲液C; 所转化液铺于选择性平板于30℃孵育3～4鉴定;
3、毕氏酵母电转化
(1)E.coli TOP10F’受态细胞制备 取10ul TOP10F’菌液接种于200ml LB液体培养基化培养37℃200 rpm16～18取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基 37℃200 rpm培养16～18 灭菌500 ml离管4℃4000 rpm20 min菌体沉淀弃清菌体用10%甘油重悬并洗涤重复洗涤3 第三离弃绝部清留约1ml 液体用于重悬菌体 制受态细胞取200ul于灭菌EP管加入连接反应产物5ul混匀要产气泡冰放置5min 混匀200ul菌液移入电击杯 使用电击穿孔仪进行转化设置电压 2500 V间 5 ms 电击往电击杯加入 800ul SOC培养基冲洗菌体转移至灭菌1.5 ml EP管37℃150 rpm 轻摇45～60 min 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml LLB-Zeocin平板放待涂布液流37℃ 培养12～16
(2)线性化质粒DNAPichia pastorisGS115转化 取新鲜制备(或-70℃冻存)受态细胞置于冰浴使其完全解冻;
1)100μl菌体移至新菌Eppendorf管加入5-20μg线性化质粒(5～10μl)轻弹混匀尽数吸转移0.2cm型电穿孔转化杯;
2) 转化杯置于冰浴5～10钟保持低温
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V;电阻：400Ω;电容：25μF;脉冲间：10mS;电击
4) 电击马电击转化杯加入1ml 4℃预冷1M山梨醇溶液用微量移液枪吹打均匀置于冰浴; 5) 取30℃烘至表面半干MD培养基平板超净工作台菌操作涂布平板400μl/板
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