我的片段是1500bp,为什么总是连不上
答案:2 悬赏:30 手机版
解决时间 2021-03-03 09:14
- 提问者网友：捧腹剧
- 2021-03-02 16:44
我的片段是1500bp,为什么总是连不上
最佳答案
- 五星知识达人网友：毛毛
- 2021-03-02 18:20
片段是经过酶切还是直接PCR获得的？如果是酶切，需要确认酶切位点正确切下来了，如果不能确认，可以先克隆到T载体上，再从T载体上往下切，保证有充分的保护碱基，以完成酶切。
如果是PCR直接获得的片段，连接到T载体，则需要确认片段是否有A尾，如果是用高保真酶扩增的，有些高保真酶不加A尾，需要有一个专门加A的过程再继续连接。
如果以上都排除，建议换一下连接酶试一下，当然，载体的质量也需要检查。如果连接产物电泳后，确实发现连接成功了，但是转化却不成功，那就要考虑筛选的抗性，表达的蛋白是否有毒性等问题了。
先一步步看看吧。
如果是PCR直接获得的片段，连接到T载体，则需要确认片段是否有A尾，如果是用高保真酶扩增的，有些高保真酶不加A尾，需要有一个专门加A的过程再继续连接。
如果以上都排除，建议换一下连接酶试一下，当然，载体的质量也需要检查。如果连接产物电泳后，确实发现连接成功了，但是转化却不成功，那就要考虑筛选的抗性，表达的蛋白是否有毒性等问题了。
先一步步看看吧。
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- 1楼网友：猎心人
- 2021-03-02 18:54
不是片段长度的问题，可能是buffer不对
再看看别人怎么说的。
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