用TAIL-PCR扩增转基因的侧翼序列,从两端扩结果都是载体上的序列
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解决时间 2021-03-25 16:16
- 提问者网友:了了无期
- 2021-03-24 19:15
用TAIL-PCR扩增转基因的侧翼序列,从两端扩结果都是载体上的序列
最佳答案
- 五星知识达人网友:行雁书
- 2021-03-24 20:22
我说说我的理解,仅供参考:
你本来的意图,是通过载体线性化后,外源基因与基因组同源位点的双交换,将其整合入基因组中,对吗?
如果说是整个环状质粒导入基因组,从理论上来说是有可能的,单酶切就可以了,而且概率比双酶切还要高,虽然我们一般都用线性材料转基因。
如果想验证一下是不是质粒整合进入的,我觉得既然TAIL-PCR就是做染色体步查的,如果你有时间,再往前走一段看看。
不过如果是环状整合的话,基因组有很大一段插入,从理论上是不能表达了。追问您好,非常感谢你的回答。载体质粒的线性化是别人做的,他告诉我是单酶切。你的意思是说有可能单酶切以后又自连接,整个环状质粒载进去,对吗?那环状质粒可以整合进基因组中吗?还是说游离在基因组外?十分期待您的回答!追答在第一次回答你问题的时候,我不知道为什么会整个环状质粒载进去,之所以那样说,是看你的问题,顺着你的意思的。我觉得应该有可能自连接后单交换整合进基因组中。
不过我后来查了一下资料,发现除了这个解释,还有其他两种可能:
1、确实单酶切切开了,但是不是通过双交换定点整合,而是随机整合进基因组中。这个整合就不一定是在目的基因那个地方了,而且是载体片段也有可能整合进去。
解决办法是利用正负筛选标记。你的TAIL-PCR之前应该是进行过正筛选的,但是有经过负筛选吗?负筛选可以杀死随机整合的细胞。
2、你做的完全正确,切开了,也定点整合了,但是你的PCR试剂有污染。要知道,PCR是很敏感的,有一点点污染就会导致错误。
为了排除这种可能,你可以再做一下。
我知道没有图,上面的话不太好理解,尤其是第一个。但是因为我的图是从书上看到的,所以不能展示给你。建议你从其他地方找找基因打靶或者基因敲除的图看看,应该会有类似《同源重组与随机整合细胞系的筛选示意图》的。参考资料:《基因工程》,孙明
你本来的意图,是通过载体线性化后,外源基因与基因组同源位点的双交换,将其整合入基因组中,对吗?
如果说是整个环状质粒导入基因组,从理论上来说是有可能的,单酶切就可以了,而且概率比双酶切还要高,虽然我们一般都用线性材料转基因。
如果想验证一下是不是质粒整合进入的,我觉得既然TAIL-PCR就是做染色体步查的,如果你有时间,再往前走一段看看。
不过如果是环状整合的话,基因组有很大一段插入,从理论上是不能表达了。追问您好,非常感谢你的回答。载体质粒的线性化是别人做的,他告诉我是单酶切。你的意思是说有可能单酶切以后又自连接,整个环状质粒载进去,对吗?那环状质粒可以整合进基因组中吗?还是说游离在基因组外?十分期待您的回答!追答在第一次回答你问题的时候,我不知道为什么会整个环状质粒载进去,之所以那样说,是看你的问题,顺着你的意思的。我觉得应该有可能自连接后单交换整合进基因组中。
不过我后来查了一下资料,发现除了这个解释,还有其他两种可能:
1、确实单酶切切开了,但是不是通过双交换定点整合,而是随机整合进基因组中。这个整合就不一定是在目的基因那个地方了,而且是载体片段也有可能整合进去。
解决办法是利用正负筛选标记。你的TAIL-PCR之前应该是进行过正筛选的,但是有经过负筛选吗?负筛选可以杀死随机整合的细胞。
2、你做的完全正确,切开了,也定点整合了,但是你的PCR试剂有污染。要知道,PCR是很敏感的,有一点点污染就会导致错误。
为了排除这种可能,你可以再做一下。
我知道没有图,上面的话不太好理解,尤其是第一个。但是因为我的图是从书上看到的,所以不能展示给你。建议你从其他地方找找基因打靶或者基因敲除的图看看,应该会有类似《同源重组与随机整合细胞系的筛选示意图》的。参考资料:《基因工程》,孙明
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- 1楼网友:老鼠爱大米
- 2021-03-24 21:53
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