求助miRNA QRT-PCR引物设计

求助miRNA QRT-PCR引物设计

miRNA引物设计（茎环法+染料法检测）

设计方法：通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上。

反转录茎环通用序列：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC

miRNA序列：

>mmu-miR-99b-5p
MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p

CACCCGUAGAACCGACCUUGCG

mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG

定量PCR反向引物为：TGTCGTGGAGTCGGC

正向引物为：CACCCGTAGAACCGAC

备注：

1
定量PCR反向引物和正向引物的TM值不要相差太大，反向引物TM已经确定，如果正向引物TM较低，则在5`端添加几个碱基（如：G）。

2
染料法的检测可能会出现引物二聚体和非特异性扩增，可以使用探针法检测，探针法和染料法相似，只是茎环上不仅有一个反向引物结合位点，还有一个探针结合位点。

我知道和使用过的u6内参基因只有两个： rnu6-1和rnu6-2.前一个就是常见的u6，后一个有时被称为u6b. 在我的大鼠rna样本当中，u6表达量有些太高，u6b的cq值与我的目标mirna比较接近，稳定性也很好。但是这些对植物样本中的内参基因选择没有什么指导意义。 为了确定u6在植物中的保守性，比较快捷的办法是找到谈论这个话题的文献综述。如果没有人写过这样的综述的话，就只能靠自己去数据库找到所有序列自己对比了。 关于内参基因的选择，必须实验确定特定样本中的表达水平稳定，其他文献中报导的内参基因不一定适合你的样本。做新的课题时，选择内参基因一般是选取3-5个常用的，pcr测试后选取。 这里有applied biosystem一篇非常好的文章讨论内参基因，里面有很多建议和备选，但都是人和小鼠中测试的。我贴链接不方便，麻烦你自己把点和斜换成标点以后使用： www3点appliedbiosystems点com斜cms斜groups斜mcb_marketing斜documents斜generaldocuments斜cms_044972点pdf 以上公司的mir pcr是茎环法，也是我使用过的，两个引物不在同一个管内，两个步骤也是完全分开先后进行的。暂时没有看到他们有内参和目标基因在同一反应管进行的mir pcr产品， 因为他们的pcr探针都用的同一种荧光。如果楼主感兴趣rt-pcr一步反应的，并且内参能够与目标mir在同一反应体系进行的产品，还要去咨询各大厂商。

miRNA引物设计（茎环法+染料法检测） 设计方法：通用茎环后端加miRNA后面6个碱基的反向互补序列为反转录引物，正向引物为miRNA去除后面6个碱基的序列，反向引物在茎环上。 反转录茎环通用序列： GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC miRNA序列： >mmu-miR-99b-5p MIMAT0000132 Mus musculus miR-99b-5p CACCCGUAGAACCGACCUUGCG mmu-miR-99b-5p反转录颈环引物为： GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCAAG 定量PCR反向引物为：TGTCGTGGAGTCGGC 正向引物为：CACCCGTAGAACCGAC 备注： 1 定量PCR反向引物和正向引物的TM值不要相差太大，反向引物TM已经确定，如果正向引物TM较低，则在5`端添加几个碱基（如：G）。 2 染料法的检测可能会出现引物二聚体和非特异性扩增，可以使用探针法检测，探针法和染料法相似，只是茎环上不仅有一个反向引物结合位点，还有一个探针结合位点。

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