怎么鉴别外源基因和内源基因的表达

怎么鉴别外源基因和内源基因的表达

将带His标签的目的基因转染细胞后，用His抗体进行免疫印迹实验，请问：1）此时得到的蛋白表达水平仅为外源基因（即转入的基因）的表达吗？2）如果用目的基因蛋白抗体进行免疫印迹实验，得到的蛋白表达水平是否应为外源基因和内源基因表达之和；3）如果有两个不同的基因都标记上同样的标签（如His), 共转染进细胞后，用His抗体是否可以同时检测两个基因的蛋白表达？
回复:
我也在用His单抗做western blot，恰恰也遇到这个问题，共同探讨
转染前首先应该明确你的目的基因在细胞中的表达情况，从你的提法看应该是有基础表达的
1）首先是转入基因能否表达的问题。真核表达载体的病毒启动子一般较核内基因组启动子高效，所以瞬转的质粒转录水平一般会高出基因组不少（从瞬转和稳转的表达量差异上也看的出来）。所以虽然你的转入基因细胞已有基础表达，你的转入基因转录本由于启动子效率优势在数量上会占优，一旦转录，细胞可不会识别你的mRNA是外来的还是原产，同等翻译（原产的还要经过复杂的剪接过程等）。所以理论上转入基因常可以胜过原产，获得足够表达，并且携带你构建上的6×his Tag。
his单抗不识别内源表达的天然蛋白，这时若用His单抗做western blot，得到的自然是你转入基因的表达情况。1、转染效率问题
首先，除非实时检测胞内质粒的动态过程，谁也不知道转染效率到底是多少。但是一般情况下，实验中只要按照条件平行、对照的原则，同批同浓度铺板，同时转染，细胞状态就认定是一致的；然后你的转染条件平行操作下，转染效率也就认定是一致的。这是科学研究的基本假设，做不到的话就成了系统误差，没得搞了。窃以为，楼主大可不必过虑这一点
实际操作上，为了证明系统的转染效率，应该设立转染阳性对照，即转染GFP等报告基因，查查看你的靶细胞能否表达GFP，然后荧光镜下一看，转染效率一目了然，瞬转如果达不到80％以上，你的系统就该继续优化，继续摸条件了。

2、表达问题
窃以为瞬转情况下没法讨论各基因表达量的差异。瞬转情况下，目的基因的转录量不同于生理下的调控，其实是仅受表达质粒上的启动子控制的，如前贴，病毒启动子是优化过的高效的，只要质粒构象好，转染成功就可以表达。至于表达后mRNA寿命和翻译效率，太复杂了，我猜测和蛋白大小、毒性等也许相关，但至少和生理状态的核内转录调控完全不是一回事了，所以觉得讨论了意义也不大。
转染后表达量也就是个定性，最多相对定量，恐怕很难奢求在一般实验中精确控制目的基因的表达量。
当然，实验至少需要证明你的基因存在一定表达量，才好讨论蛋白生理功能。我觉得你只要转染后分出部分细胞用RT－PCR或Western blot证明存在表达就可以说明，或者就做荧光融合蛋白，把你的目的基因A、B都与GFP、DsRed等融合，荧光显微镜一看，转染效率一目了然不说，还可以证明其存在表达。很有说服力。
2）用目的基因抗体时，只要你的单抗识别表位不过分接近你的HIS Tag位置，应该是同样检测外源重组蛋白和内源蛋白，且二者分子量在增加6×his后没有太大变化，条带位置重叠，所以检测到的是表达之和。
3）可以！只要两个蛋白分子量分得较开。这个我们做过的，加一抗时一般是过量的，检测两个蛋白绰绰有余。当然也和你的His单抗质量有关，如果条带较淡可以调整一抗稀释倍数。
提醒：His单抗不要图便宜，买好点贵点的，尤其是检测两条带的时候。由于天然蛋白有时也有3×以上的His，有些特异性不好的便宜货的常常识别很多杂带出来。很郁闷的。
我们实验设计很像嘛，多多讨论，实验顺利！！

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