为什么用OD260/OD280评定核酸纯度

为什么用OD260/OD280评定核酸纯度

紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日 星期二 11:40目的： 了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。 紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器： 提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如OD₂₆₀=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。4) 若OD₂₆₀/OD₂₈₀大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。

核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1 OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；寡核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。
通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）可以估计核酸的纯度。纯DNA的比值为1.8，纯RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。样品中如混有RNA比值上升。

我们知道 核酸的特征紫外吸收峰在260nm，蛋白质的特征吸收峰在280nm。
一般情况下，在核酸提取过程中，最容易被污染的物质是蛋白质。因此分别测定核酸与蛋白质在其各自特征波长下的吸光度，以其比例系数就可以衡量核酸纯度了。

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