求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

求助成年小鼠SVZ取材详细步骤

1、取8周龄C57雄性小鼠，腹腔麻醉。
　　2、头部70％酒精消毒。
　　3、剪刀从颈部断离头部，剪开头皮、颅骨，取出大脑，置于盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中。" A" ?) x* g# U$ H! ^# V
　　4、去除血迹，放入另一盛有冰的无菌D’Hanks的小皿中，去除脑膜，在显微镜下操作。
　　5、将大脑约1／2处横断，保留前脑(近嗅球端)，沿中线分为两半。9 ^& b6 Q7 Q! O/ ^
　　6、将半脑外侧面朝下，用一只镊子固定，另一只镊子去除剩余的海马、SVZ内侧壁，见SVZ外侧壁呈月牙型，上下侧与白质相连，界限清晰。
　　7、分离之，去除四周的白质纤维。取出置于无菌的1．5毫升Eppendorf离心管中，置于冰中。! H+ ?" u/ I! a) b1 D! Z" ~
　　8、同样分离另一侧的。1 U+ n* Q. Y' s" s
　　9、每个离心管中加入400ul的0.1％含EDTA的胰酶。
　　10、轻柔吹打5～10次，将组织吹打成细块状(使用1000ul的蓝色枪头)。
　　11、37℃孵育10分钟。每个样本组织再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织消化成小的颗粒。
　　12、37℃再次孵育10分钟，再轻柔吹打(用2001xl的枪头)约20次，使得SVZ组织完全消化成单个细胞。+ U4 h- ~( 8 r1 Y
　　13、可以酌情延长消化时间和次数，最终使得组织完全消化成单个细胞。
　　14、每个离心管中加入4001xl的NSCs培养基终止消化。, & z& p" u! T, ?5 Z4 g7 r
　　15、常温下O.3 rcf离心3分钟。# ]4 h. i9 l: p( L- f
　　16、去上清，加入培养基洗涤一次，再次0．3 rcf离心3分钟。& m8 {' z6 N) g. H# Z
　　17、去上清，加入培养基轻柔的重悬细胞。
　　18、移入50ml的培养瓶中培养，每瓶加约10ml培养基（培养基为DMEM/F12(1:1)，每50ml中添加了青霉素．链霉素500微升，N2 500ul， B27 1ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)20ng/ml）。约7～8天后神经球形成。$ B8 g6 W. H" H1 h* s  E' l+ Y
　　19、将培养瓶放置在倒置显微镜下进行神经球计数。4 E! r& d5 h( \% K& A* @$ n5 j
　　20、在24小时后换液一次，换出死细胞和其它杂质。7 m9 P8 W; ^9 R% U% @7 n1 L
　　21、观察到神经球长到约200um大小时即可传代。

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