(9分)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题：图1　转基因操作流程图表2　几种限制

(9分)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题：

图1　转基因操作流程图

表2　几种限制酶识别序列及切割位点表
(1) 获取真核生物的基因通常采用人工合成法，通过图示中①方法合成的耐盐碱基因中是不含 的，如果要将耐盐碱基因和质粒重组，应该在基因两侧的A和B位置除了接上以上两个结构外还需分别加入 限制酶识别序列，这样设计的优点有利于质粒和目的基因定向连接。
(2) 过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物Ⅰ和引物Ⅱ等物质，若目的基因扩增4代，则共用了引物Ⅰ 个。
(3) 请画出Pst Ⅰ切割DNA形成黏性末端的过程： 。
(4) 图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是 。
(5) 在步骤⑤⑥过程中都需用 处理两类细菌。为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常从分子水平进行检测的方法是用 法。
(6) 假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻进行减数分裂的细胞在联会时有 个D基因。(1) 启动子和终止子　EcoRⅠ、SmaⅠ
(2) 15
(3)
(4) 获取大量重组质粒(让目的基因扩增)
(5) Ca2＋　抗原—抗体杂交
(6) 2

(答案→)(1) 启动子和终止子　EcoRⅠ、SmaⅠ(2) 15(3)(4) 获取大量重组质粒(让目的基因扩增)(5) Ca2＋　抗原—抗体杂交(6) 2 解析：（1）由于目的基因的非编码区不转录形成mRNA，所以反转录获得的基因不含非编码区，即不含启动子和终止子。为了有利于质粒和目的基因定向连接，应选择双酶切，即选择EcoRⅠ、SmaⅠ。（2）目的基因扩增4代，共形成16个DNA，需引物15个。（3）黏性末端由两条链构成。（4）将重组质粒导入大肠杆菌的目的是让目的基因扩增，获取大量重组质粒。（5）将目的基因导入细菌的方法是用Ca2+处理，使之处于感受态，检测目的基因是否翻译出蛋白质，方法是抗原－抗体杂交法。（6）该转基因水稻中有一个基因D，联会时DNA已复制，此时有2个D基因。

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