大豆DNA的提取

大豆DNA的提取

分子生物学的发展迅速,生物技术的研究领域逐渐拓宽到生物科学的各个方面。大豆作为我国乃至世界的重要作物,国内外已经开展了大量的基础生物学研究和分子辅助育种,但进行生物技术研究的基础是高质量的大豆DNA提取。大豆的DNA提取相对较容易,但也常常有蛋白质、糖类和其它物质的污染,对实验结果时常造成影响。本文根据实验经验和查阅有关文献,对大豆DNA提取的基本原理进行了总结。 1 DNA提取方法的命名 大豆DNA提取的方法很多,如提取质量高,得 率较低的CTAB(溴化十六烷三甲基铵)法;提取得率高,质量较好的SDS(十二烷基磺酸钠)法;用于少量提取的SarcosylCTAB,SDS,Sarcosyl都是洗涤剂性质的化学药品,主要的破膜成份,可将细胞内的物质释放出来。 2 DNA提取所用材料 大豆DNA提取所用的材料可以是种子、幼苗 或叶片、根系、茎等各部分组织。在分子生物学上常用的材料是叶片,转基因检测或进口大豆检测时常用到子粒。利用叶片作为提取材料时,若在田间种植材料,并做其它特性特性鉴定的情况下,多是在长出3～5片三片复叶时,取上部嫩叶,选用较嫩的叶片 材料才可能显著提高提取的DNA浓度〔7〕。但要保 收稿日期:2003-04-07作者简介:陈庆山(1973-),男,讲师,研究方向为大豆分子生物技术 和遗传育种。 留生长点;若种植材料只是为取叶片提取DNA时,可在室内用营养钵种植,长出足够嫩叶即可取叶片。抽提DNA中主要杂质为碳水化合物,同时为了减少叶绿素对提取DNA纯度和颜色的影响,在采样前将取样植株在暗室放置2～3d,可以大大降低叶片中可溶性碳水化合物的含量,从而提高提取DNA的纯度〔8〕 。根据所用材料的不同而采取不同的提取方法,通常对于叶片DNA的提取采用SDS法,而大 豆子粒或大豆粉采用CTAB法效果较好〔9～11〕 。 3 DNA提取步骤 大豆DNA提取无论采取传统的CTAB法、SDS法还是采用现在所改良的一些方法,其步骤有繁有简,但归纳起来都要进行以下5个方面工作:破壁,破膜,抽提,沉淀和溶解。各实验室和各提取方法有一些差异,但原理一致。3.1 破壁(破坏细胞壁) 植物DNA提取与动物不同,植物细胞与组织具有较硬的细胞壁,大量酚类、色素、多糖、单宁等物质,给DNA的提取与纯化带来许多困难 〔12〕 。所以提 取时必须先破坏细胞壁。用叶片作为材料破壁的方法最常用的是液氮研磨法,尽量取鲜嫩叶片,放入研钵,加入液氮研磨,一般要加入3～4次液氮。研磨好的特征是叶片粉末颜色由绿变白。如果研磨样品量非常少(如转基因植株检测),可将叶片放入1.50mL的Eppendorf离心管,将离心管放入液氮中,用塑料杆头的电钻研磨,效果较好。一些实验室有使用玻璃匀浆器的,但效果不是很好。3.2 破膜(破坏细胞膜,释放细胞内物质) 破膜的主要成份是去污剂,如上面所列举的CTAB、SDS、Sarcosyl等。还有Tris・Cl、EDTA、NaCl等成份。Tris・Cl是缓冲液,提供一个pH值稳定的环境;EDTA可以螯合金属离子,而某些金属离子对酶类的活性是至关重要的,如Mg2+ 。如果酶不能与金属离子结合,酶就失去了活性,核酸酶类也是如此,所以EDTA可避免提取DNA时核酸酶类污染,造成DNA的降解;NaCl可以提供一个高盐的环境,为进一步去除蛋白质所必需的。而1mol・L-1的NaCl浓度是大豆新鲜叶片快速分离DNA的理想 条件〔6〕 。DNA提取液要特别注意pH值,因为在偏酸的条件下,RNA稳定,而DNA不稳定,在偏碱的条件下,DNA稳定,而RNA不稳定,因而DNA提取液pH值应在8.0左右,pH值的调节应重点放在EDTA溶液的配制上。 3.3 抽提(去掉蛋白质及其它杂质) 抽提的主要目的是去除蛋白质。去除蛋白质的试剂主要是苯酚和氯仿。苯酚应使用pH值为8.0的Tris饱和酚,碱性环境可以保证DNA不被降解,因而不能使用pH值为5.0的水饱和酚。苯酚去除蛋白质的效果比较好,但苯酚与水相溶,二者不分层,不能很好地去除苯酚,而苯酚长时间存在会导致DNA降解。为了避免这种情况发生,常常用酚仿试剂,即苯酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的混合液。氯仿也有抽提蛋白质的作用,但效果不是太好。苯酚在氯仿中的溶解度比在水中的溶解度高,因而苯酚更易溶于氯仿中。氯仿与水不溶,二者分为两相,即会出现分层现象。通过离心,可以使分层更为彻底,从而除掉苯酚及氯仿。异戊醇主要是减少抽提过程中翻转产生的泡沫,达到较好的抽提效果。也有人采用氯仿—异戊醇代替酚抽提,由于氯仿—异戊醇易溶于异丙醇,并易于挥发,由此克服了由于酚等的残 留带来的DNA降解及酶切上的困难〔13〕 。3.4 沉淀(沉淀DNA) 沉淀常用试剂为异丙醇和乙醇。大量DNA提取时,一般用预冷(-20℃)的异丙醇进行沉淀,即根据DNA抽提后得到上清液的体积加入等体积预冷的异丙醇。有人在抽提前和抽提后分别用异丙醇进行沉淀,DNA得率提高。这是因为用异丙醇反复沉 淀,有利于特异性地沉淀核酸,提高核酸的产量〔13〕 。总的来讲,用异丙醇沉淀DNA的效果较好,但也有一个突出的缺点,就是异丙醇不容易挥发出去,这对后期DNA溶解有不良影响。无水乙醇的沉淀效果 没有异丙醇好,沉淀时往往加入量大,即根据DNA 抽提后得到上清液体积加入二倍体积的无水乙醇。无水乙醇的优点是易挥发,容易去除。为了解决这些矛盾,实验中常常先用异丙醇沉淀DNA,再用70%酒精清洗,这样70%洒精就可将异丙醇溶解出来,而酒精又可挥发出去。因此在精提DNA时,常只用无水乙醇沉淀,而不用异丙醇。沉淀要注意的另外一个问题是,当将抽提后的上清加入异丙醇或乙醇时,不应太急,要缓缓地旋转地加入,而且沉淀时要避免上下颠倒,以免导致DNA降解。3.5 溶解(溶解DNA) 溶解DNA一般采用两种方法。一种方法是用超纯水溶解,另一种是用TE缓冲溶液溶解。用超纯水溶解不利于DNA的长期保存,因为在水中DNA双链不很稳定,易降解。其优点是可以直接用于各种生物技术操作。TE缓冲溶液中含有Tris・Cl和EDTA,可以维持DNA双链的稳定性。EDTA是金属离子的螯合剂,可防止各种核酸酶的酶解,但也会抑制实验中各种酶的活性,影响实验结果,所以TE缓冲溶液溶解的DNA在使用时需要沉淀,用超纯水重新溶解。因此,DNA长期保存时,应用TE缓冲溶液溶解;而DNA提取后立即用于实验时,则应用超纯水溶解。 4 小 结 对于DNA的提取,进行各种试剂和方法的研究,在不同实验条件和不同操作人员效果不同。如能遵循上述基本原理,大豆DNA的提取将得到较好结果。在DNA提取时,不能简单地按照操作步骤中的时间或离心的转速,应注意各个步骤中的典型特征是最重要的。如破壁时叶片的由绿变白,抽提时的蛋白质沉淀析出等。只有掌握这些特征,实验才能做到有的放矢,及时调整实验中的不定因素,得到好的结果。谢谢请给我一个好评

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