pcr反应哪一步要循环？还是变性、退火、延伸整个一起循环？

pcr反应哪一步要循环？还是变性、退火、延伸整个一起循环？

1、预变性（Initial denaturation）　　模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。
2、循环中的变性步骤　　循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可 缩短该步骤时间

　　变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
3、引物退火（Primer annealing）　　退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。
4、引物延伸　　引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略

　　延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
5、循环数　　大多数PCR含25-40循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸　　在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

其中第2到第4步要循环即变性、退火、延伸都要循环

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