为什么只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达

为什么只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达

专题1 基因工程 1.1 DNA重组技术的基本工具 1.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA? 提示：迄今为止,基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的,它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列.细菌中限制酶之所以不切断自身DNA,是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,对于外源入侵的DNA可以降解掉.生物在长期演化过程中,含有某种限制酶的细胞,其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列,或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上,使限制酶不能将其切开.这样,尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断,并且可以防止外源DNA的入侵. 2.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么? 提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid）,即独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子.是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢?其实不然,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件. （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基因可以插入到载体上去.这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置,还必须是在质粒本身需要的基因片段之外,这样才不至于因目的基因的插入而失活. （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制. （3） 载体DNA必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选. （4） 载体DNA必需是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去. （5） 载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作. 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件,都要进行人工改造后才能用于基因工程操作. 3.DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗? 提示：迄今为止,所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力,至于原因,现在还不清楚,也许将来会发现可以连接单链DNA的酶. 4.根据你所掌握的知识,你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗? 提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵,但是,生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制,以防止外来病原物的侵害.限制酶就是细菌的一种防御性工具,当外源DNA侵入时,会利用限制酶将外源DNA切割掉,以保证自身的安全.所以,限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效,从而达到保护自身的目的. 5.DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么? 不是一回事.基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的,称之为E?coli连接酶.另一种是从T4噬菌体中分离得到,称为T4连接酶.这两种连接酶催化反应基本相同,都是连接双链DNA的缺口,而不能连接单链DNA.DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键,那么,二者的差别主要表现在什么地方呢? （1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上,形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键.（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来.因此DNA连接酶不需要模板.此外,二者虽然都是由蛋白质构成的酶,但组成和性质各不相同. 6.具备什么条件才能充当“分子运输车”? 提示：能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等. 7.（1）限制酶所识别的序列有什么特点? 限制酶所识别的序列,无论是6个碱基还是4个碱基,都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的. （2）限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗? 任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列,这是由限制酶的性质所决定的. （3）DNA连接酶连接的是什么部位? DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键,而不是连接互补碱基之间的氢键. 1.2 基因工程的基本操作程序 1.作为基因工程表达载体,只需含有目的基因就可以完成任务吗?为什么? 答：不可以.因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子、终止子和标记基因等.必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流,只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他调控元件,如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因）,如绿色荧光蛋白基因等. 2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗?若想将一个抗病基因导入单子叶植物,如小麦,从理论上说,你应该如何做? 提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌,在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多.根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中,裸子植物对该菌也敏感.当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤.根瘤农杆菌具有趋化性,即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中.研究证明,这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成,通常不存在于单子叶植物中,这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因.利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时,是需要加上述酚类物质的,同时单子叶植物种类不同,农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异.如果想将一个抗病毒基因转入小麦,也可以用农杆菌,但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株,因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因,使T-DNA转移并插入到染色体DNA上. 3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素,联系前面有关细胞器功能的知识,结合基因工程操作程序的基本思路,思考一下,若要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗? 提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的,内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中,大肠杆菌不存在这两种细胞器,因此,在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的. 4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分.当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症.假如让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白,想一想,应如何进行设计? 提示：基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）. （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体. （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌.如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明β-珠蛋白基因已进入其中. （4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取β-珠蛋白. 5.你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗? 反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链.像其他DNA聚合酶一样,反转录酶也以5′→3′方向合成DNA（图1-3）. cDNA合成过程是：第一步,反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链,形成RNA-DNA杂交分子.第二步,核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解,使之变成单链的DNA.第三步,以单链DNA为模板,在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链,形成双链DNA分子. 6.PCR的扩增过程是怎样的? PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法,也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法.PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程. 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃,使双链DNA模板两条链之间的氢键打开,变成单链DNA,作为互补链聚合反应的模板. 第二步：将反应体系降温至55～60 ℃,使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对,这个过程称为复性. 第三步：将反应体系升温至70～75 ℃,在耐高温的DNA聚合酶催化作用下,将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA链延伸,产生一条与模板链互补的DNA链. 上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的. 7.什么是分子杂交技术的显示带? 分子杂交技术是基因工程中使用频率很高的一项技术,主要用于检测和鉴定,可以分为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交.常用的技术有： Southern杂交──DNA和DNA分子之间的杂交.目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中,这在真核生物中是目的基因可否稳定存在和遗传的关键.如何证明这一点,就需要通过Southern杂交技术.基本做法是：第一步,将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后,走琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的片段分开；第二步,将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三步,用标记了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步,将X光底片压在硝酸纤维素膜上,在暗处使底片感光；第五步,将X光底片冲洗,如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因. Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交.它是检测目的基因是否转录出mRNA的方法,具体做法与Southern杂交相同,只是第一步从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA,杂交带的显现也与Southern杂交相同. Western杂交──蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交.它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法. 1.3 基因工程的应用 1.表1-1 转基因生物与目的基因的关系转基因生物\x09目的基因\x09目的基因从何来抗虫棉\x09Bt毒蛋白基因\x09苏云金芽孢杆菌抗真菌立枯丝核菌的烟草\x09几丁质酶基因和抗毒素合成基因\x09 抗盐碱和干旱作物\x09调节细胞渗透压的基因\x09 耐寒的番茄\x09抗冻蛋白基因\x09鱼抗除草剂大豆\x09抗除草剂基因\x09 增强甜味的水果\x09降低乳糖的奶牛\x09 甜味基因\x09肠乳糖酶基因\x09 生产胰岛素的工程菌\x09人胰岛素基因\x09人 2.利用微生物生产药物的优越性何在? 所谓利用微生物生产蛋白质类药物,是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因,构建成表达载体后导入微生物,然后利用微生物发酵来生产蛋白质类药物.与传统的制药相比有以下优越性：（1）利用活细胞作为表达系统,表达效率高,无需大型装置和大面积厂房就可以生产出大量药品.（2）可以解决传统制药中原料来源的不足.例如,胰岛素是治疗糖尿病患者的药物,一名糖尿病患者每年需用的胰岛素需要从40头牛或50头猪的胰脏中才能提取到.1978年科学家用2 000 L大肠杆菌发酵液得到100 g胰岛素,相当于从1 000 kg猪胰脏中提取的量.又如,生长素是治疗侏儒症患者的药物,治疗一名侏儒症患者每年需要从80具尸体的脑下垂体中提取生长素.利用基因工程菌发酵生产就不需要从动物或人体上获取原料.（3）降低生产成本,减少生产人员和管理人员. 1.4 蛋白质工程的崛起 1.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同? 答：基因工程是遵循中心法则,从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能,基本上是生产出自然界已有的蛋白质.蛋白质工程是按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列,可以创造自然界不存在的蛋白质. 2.你知道酶工程吗?绝大多数酶都是蛋白质,酶工程与蛋白质工程有什么区别? 提示：酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用,借助工程学的手段,应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术.概括地说,酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的.酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中.α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和葡萄糖异构酶这三个酶连续作用于淀粉,就可以代替蔗糖生产出高果糖浆；蛋白酶用于皮革脱毛胶以及洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性缺酶病或是器官缺损引起的某些功能的衰竭等.至于我们日常生活中所见到的加酶洗衣粉、嫩肉粉等,就更是酶工程最直接的体现了.通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂,而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构,然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤.因此,酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用,而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造.当然,随着蛋白质工程的发展,其成果也会应用到酶工程中,使酶工程成为蛋白质工程的一部分. 3.对天然蛋白质进行改造,应该直接对蛋白质分子进行操作,还是通过对基因操作来实现? 毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造,主要原因如下：（1）任何一种天然蛋白质都是由基因编码的,改造了基因即对蛋白质进行了改造,而且改造过的蛋白质可以遗传下去.如果对蛋白质直接改造,即使改造成功,被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的.（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作,难度要小得多. 4.动物乳腺生物反应器? 1987年美国科学家戈登（Gordon）等人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）,展示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性.利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为动物乳腺反应器. 为什么要用动物乳腺作为反应器生产高价值的蛋白质产品呢?这是因为动物乳房是一种高度分化的专门化腺体,合成蛋白质的能力非常强,尤其是一些经过长期的遗传改良,专门产奶的乳用动物品种,蛋白质合成能力更是惊人.一头优质奶牛,一年可产奶10 000 kg.即便是一只奶山羊,一年也可产奶2 000 kg.动物乳腺生物反应器归纳起来有四大优点：①产量高,且易收获目标产品,可以随乳汁分泌而排出动物体外；②目标产品的质量好.动物乳腺组织不仅具有按遗传信息流向合成蛋白质的能力,而且具备一整套对蛋白进行修饰和加工的能力,如糖基化、羧化、磷酸化以及分子组装等,而微生物和植物系统都不具备这种全面的蛋白质后加工能力；③产品成本低；④从奶牛中提取产品,操作比较简单.

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