试述农杆菌介导的植物遗传转化中外植体培养主要有哪些阶段
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解决时间 2021-02-04 10:25
- 提问者网友：战皆罪
- 2021-02-03 12:09
试述农杆菌介导的植物遗传转化中外植体培养主要有哪些阶段
最佳答案
- 五星知识达人网友：一叶十三刺
- 2021-02-03 12:34
1．种子消毒
成熟的水稻(Rice)种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
2．继代培养
经过近1月的诱导，水稻(Rice)长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
3．农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素(antibiotic)）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，终浓度100uM）。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基（含AS 100uM）重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此时可用来转化愈伤组织。
4．共培养
将水稻(Rice)胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培养三天。
5．洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
6．选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再选择3周。
5．分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麦芽糖30g/L）上暗培养10天左右，再转到分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麦芽糖30 g/L）上光照培养。
7．生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上诱导不定根的发生。
8．转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
成熟的水稻(Rice)种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，无菌水冲洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿约30粒，于28℃暗培养。
2．继代培养
经过近1月的诱导，水稻(Rice)长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上进行继代。每2周继代一次，一般继代2-4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。
3．农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素(antibiotic)）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃培养5-6hr至OD600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，终浓度100uM）。取上述菌液在室温下，4000rpm，10min，弃上清，加入MS液体培养基（含AS 100uM）重悬菌体，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此时可用来转化愈伤组织。
4．共培养
将水稻(Rice)胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培养三天。
5．洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。
6．选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再选择3周。
5．分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麦芽糖30g/L）上暗培养10天左右，再转到分化培养基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麦芽糖30 g/L）上光照培养。
7．生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上诱导不定根的发生。
8．转基因苗的移栽
当幼苗长至10cm高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
全部回答
- 1楼网友：春色三分
- 2021-02-03 14:04
.问题分析：.就目前病因学研究结果看,癌症与遗传有关,但癌症并不会直接遗传.不同的肿瘤可能有不同的遗传传递方式,而遗传因素在大多数肿瘤发生中的作用是对致癌因子的易感性或倾向性.所谓癌症遗传易感性,是指在相同生活条件下的人群中,有的个体有更易发生癌症的倾向.在一定的遗传特征的基础上,癌症是否形成,还取决于精神因素,环境因素,饮食因素及生活习惯等诸多后天因素及外界致癌物的综合作用.
.意见建议：.您好，晚期患者以控制癌细胞扩散延长患者生命为治疗目的，建议中医中药保守治疗，控制病情稳定
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