红墨水染色法的实验原理是什么？

红墨水染色法的实验原理是什么？

实验七 种子 生活力的快速测定 种子生活力（ seed viability ）是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。测定种子生活力常采用萌发实验，即在适宜的条件下，让种子吸水萌发，在规定的时间内统计发芽种子的百分数。但是，采用发芽实验测定种子的生活力所需时间较长，有时在生产上或种子贸易过程中，需要较快地知道种子的生活力，采用萌发实验就无法满足这些要求。另外，处在休眠状态下的种子虽然不能萌发，但仍然具有生活力，显然，采用萌发实验是无法测定休眠种子的生活力的。而采用以下的化学方法，可以较快地测定种子的生活力。一、 TTC 法【实验原理】 德国的 G. Lakon 发明的 TTC 法，简单实用，其原理是：有生活力的种子能够进行呼吸代谢，在呼吸代谢途径中由脱氢酶催化所脱下来的氢可以将无色的 2 ， 3 ， 5 - 三苯基氯化四唑（ 2 ， 3 ， 5 - triphenyl tetrazolium chloride 简称为 TTC ）还原为红色、 不溶性 的甲月替，而且种子的生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深。死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将 TTC 还原为红色。 种胚生活力衰退或部分丧失生活力，则染色较浅或局部被染色。 因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力。 【实验材料】 绿豆、水稻、小麦、玉米 、油菜 或其它植物种子。 【仪器设备】 恒温箱、小白瓷碗、镊子、刀片、小烧杯 。 【试剂药品】 0.5% TTC 溶液：称取 0.5 g TTC 放入小烧杯中，先加少许乙醇溶解后，再用蒸馏水稀释定容至 100 mL 。 TTC 溶液最好随用随配，不宜久藏。溶液应遮光贮藏。若已变为红色，则不能继续使用。 【实验步骤】 • 浸种：将待测种子用温水（ 30 ℃ ~35 ℃）浸泡 2 － 6 h ，使种子充分吸胀。 • 显色：随机取吸涨种子 100 粒，小心剥去种皮或外壳，务必不要伤害种胚。然后将处理好的种子置于 小白瓷碗中，加入 0.5% TTC 溶液，以浸没种子为度，于恒温箱（ 30 ℃ ~35 ℃）中保温 0.5~1 h 。另取 100 粒吸涨种子，于沸水中煮 5 min 后，再加入 0.5%TTC 溶液染色。 • 统计：染色结束后要立即进行鉴定，因放置太久会褪色。倒出 TT C 溶液，再用清水将种子冲洗 l~2 次，观察种胚被染色的情况。凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生活力的种子，种胚不被染色的为死种子。如果种胚中非关键性部位（如子叶的一部分）被染色，而胚根或胚芽的尖端不染色，都属于不能正常发芽的种子。根据上述标准鉴定煮沸和未煮沸种子的生活力。二、染料染色法【实验原理】 生活细胞的原生质膜具有半透性（选择透性），能选择性地吸收外界（有用）物质，而死亡的细胞则丧失了这一能力。一般染料不是细胞生活所需要的物质，因而不能进入生活细胞内。根据这一原理，人们可以利用染料染色法来鉴定种子的生活力：有生活力的种子，胚部细胞不让染料进入，因而不被染色；而丧失生活力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择透性，染料可自由进入细胞内，从而使胚部染色。因此，可根据种胚是否被染色来判断种子的生活力。 【实验材料】 水稻、玉米、大豆、棉花、小麦或一些树木种子。 【仪器设备】 小烧杯，刀片，镊子。 【试剂药品】 0.02 ％ ~ 0.2 ％ 靛红溶液或 5 ％红墨水（酸性大红 G ）。 【实验步骤】 同 TTC 法。 【注意事项】 • 染料的浓度要适当，染色时间也不能太长（如用红墨水染色，只需 5~10 min 即可），否则不易区别染色与否。 • 染料染色法测定种子生活力，以靛红染色法应用较广，它适用于禾谷类、豆类、麻类、瓜类、十字花科、棉花、果树、乔灌木种子生活力的测定。三、碘化钾反应法【实验原理】 某些种子（松属、云杉属和落叶松属）在发芽过程中，胚内会形成和积累淀粉。淀粉在碘试剂作用下产生蓝色反应，从而可根据胚中产生蓝色反应的程度来判断种子的生活力。 【实验材料】 云杉、松和落叶松的种子。 【仪器设备】 玻璃板 ，培养皿，滤纸，其余用品同 TTC 法。 【试剂药品】 碘一碘化钾溶液：把 1.3g 碘化钾溶解在水中，再加入 0.3g 结晶碘，然后定容至 100 mL 。 【实验步骤】 • 将种子在水中浸泡 18 h 。 • 取出放在垫有湿滤纸的培养皿内，将培养皿置于 30 ℃恒温箱中。松和云杉种子放 48 h ，落叶松放 72 h 。 • 用刀片把胚部切下，然后浸入碘一碘化钾溶液中 20 － 30 min 后，取出胚用水冲洗 12 min ，然后在垫有白纸的玻璃板上进行观察。 • 鉴别种子生活力的标准是：有生活力种子的胚部全部染成不同程度的黑色至灰色，或者胚根部呈褐色，子叶为黄色。无生活力种子的胚部全部染成黄色，或子叶呈灰色或黑色，胚根呈黄色，或胚根末端呈黑色或灰色，而其他部分呈黄色。 • 此法适于松属、云杉属和落叶松属种子生活力的测定。 四、荧光法【实验原理】 植物种子中常含有一些能够在紫外线照射下产生荧光的物质，如某些黄酮类、香豆素类、酚类物质等。在种子衰老过程中，这些荧光物质的结构和成分往往发生变化，因而荧光的颜色也相应地有所改变； 有些 种子在衰老死亡过程中，内含荧光物质的结构和成分虽然没有改变，但由于生活力衰退，细胞的原生质透性增加，当浸泡种子时，细胞内的荧光物质很容易外渗。因此，可以根据前一种情况直接观察种胚荧光的颜色，或根据后一种情况观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生活力。 【实验材料】 待测的植物种子， 【仪器设备】 紫外光灯，白纸（不产生荧光的），刀片，镊子，培养皿，烧杯。 【实验步骤】 • 直接观察法 该法适用于禾谷类、松柏类及某些蔷薇科果树种子生活力的鉴定，但种间的差异较大。 用刀片沿种子的中心线将种子切为两半，使其切面向上放在无荧光的白纸上，置于紫外光灯下照射并进行观察、记载。有生活力的种子在紫外光的照射下将产生明亮的蓝色、蓝紫色或蓝绿色的荧光；丧失生活力的死种子在紫外光照射下多呈黄色、褐色以至暗淡无光，并带有多种斑点。 随机选取 20 粒待测种子，按上述方法进行观察并记载有生活力及丧失生活力的种子的数目，然后计算有生活力种子所占百分数。与此同时也作一平行的常规发芽试验，计算其发芽率作为对照。 • 纸上荧光 随机选取 50 粒完整无损的种子，置烧杯内加蒸馏水浸泡 10 ~ 15 min 令种子吸胀，然后将种子沥干，再按 0.5 cm 的距离摆放在湿滤纸上（滤纸上水分不宜过多，防止荧光物质疏散），以培养皿覆盖静置数小时后将滤纸（或连同上面摆放的种子）风干（或用电吹风吹干）。置紫外光灯下照射，可以看到摆过死种子的周围有一圈明亮的荧光团，而具有生活力的种子周围则无此现象。根据滤纸上显现的荧光团的数目就可以测出丧失生活力的种子的数量，并由此计算出有生活力种子所占的百分率。此外，可与此同时作一平行的常规种子萌发试验，计算其发芽率作为对照。 这个方法应用于白菜、萝卜等十字花科植物种子生活力的鉴定效果很好。但对于一些在衰老、死亡后减弱或失去荧光的种子便不适用此法，因此，对它们只宜采用直接观察法。 【思考题】 TTC 法、染料染色法、碘化钾反应法和荧光法快速测定种子生活力的理论依据是什么？各种方法在实验操作中应注意些什么？

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