过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

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解决时间 2021-03-20 03:46

提问者网友：半生酒醒
2021-03-19 04:21

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？

最佳答案

五星知识达人网友：往事埋风中
2021-03-19 05:56

首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的 PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的干扰更大，很容易造成测序失败。--------转自三博远志网站(测序FAQ)

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1楼网友：一把行者刀
2021-03-19 06:49

这里有两个问题，pcr产物测序和pcr过短的问题熟悉pcr产物测序原理就明白，前面20-30个bp测出来市数据是不准确的，测序范围大概是800左右，超过的需要双向测序。过短的pcr产物，pcr测序肯定需要纯化的，如果太短的话，在胶回收的时候很可能影响pcr产物浓度。一般pcr送样测序的条件A未纯化PCR产物的要求，1. 片段大于200bp；2.请提供50ul PCR扩增产物(总量1ug-2ug)；3.取3ul样品，应该能够清晰的分辨出目的条带；自带引物，引物浓度不低于5uM,并请注明。B纯化后PCR产物的要求1.PCR产物溶于蒸馏水中(请勿溶解在TE溶液中)； 2.浓度大于20ng/ul，体积大于10ul，长片段需适当增加量；3.电泳检测条带专一；自带引物价格都不是很贵，一般能22-25元一次。

2楼网友：第四晚心情
2021-03-19 06:17

不能直接测序。该pcr产物理论上是一个复合物，测序结果理论上是套峰，因为单个cpg岛甲基化是有概率的，0%-100%都可能。

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