求助ELISA抗体稀释的问题

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解决时间 2021-03-19 07:07

求助ELISA抗体稀释的问题

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抗体稀释可以用厂家推荐浓度为基础，而后进行上下梯度设计。从而获得最佳条件。

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做双抗体夹心elisa 夹心抗体的选择

单克隆抗体制备时很多朋友会遇到这样的问题，即我们免疫用的蛋白为原核表达蛋白而目的蛋白是真核蛋白或病毒等，因为没有标准品我们做出来的抗体没有办法用标准品来验证是否与其发生反应，最终导致我们做出的是无用抗体。本人亲身经历，总结一下几种方法供大家参考，希望对大家有所帮助。

原料：

双抗体夹心寻找配对抗体问题

双抗体夹心elisa

方法步骤：

若要检测的抗原为某种新的病毒（你手上没有该种病毒或全世界都没有分离出该病毒，该病毒为最近报道而你在病料中克隆到了该病毒基因且做了原核表达并做了抗体）

方法：

1、大量做出该病毒某个蛋白的单克隆抗体（该蛋白基因是你在病料中得到）；

2、大量采集该病毒疑似感染动物或人血液，用pcr的方法进一步确定每份血液是否真的有该病毒存在；

3、将你做出的大量抗体中的一个做标记作为标记抗体，其他所有抗体作为包被抗体，检测第二步中确定阳性的血清，结果与阴性血清做对比，并画出点状分布图。若阳性血清大部分的点在阴性血清之上恭喜你找到配对抗体了；若结果相差不大，请重新标记一株抗体做相同实验。

此法工作量较大，但你想早日发paper就不要嫌麻烦了。

若要检测抗原为某一细胞因子（该细胞因子在市场上没有真核表达的成品；）

方法：

1、通过超表达的方法建立稳定表达的细胞系，注意要在目的蛋白上加相应的标签，以便纯化。若仅仅是找到配对抗体则不需要纯化甚至不需要建立稳定表达的细胞系瞬时转染就可实现，若要进一步作出标准曲线请纯化。

2、将细胞系建立后，我们就可以拿到标准品了，做配对工作就相应简单，不再赘述。

3、若该种细胞因子可有某种阳性刺激物大量刺激而来，也可不做细胞系。用阳性刺激物刺激，我们细胞刺激物的上清液来做标准品也可以。

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