水稻基因组计划的水稻基因组测序

水稻基因组计划的水稻基因组测序

基因组测序涉及DNA的大规模测序，由于目前只能采取分而治之的测序基本策略，即将基因组DNA分割成一定大小的片段，然后分别对这些片段进行测序。而遗传图和物理图可作为整个基因组测序的路标，为小片段DNA测序和重叠群构建提供了基础。 已获得高密度水稻遗传连锁图，为何不能直接指导基因组计划的测序，还要绘制物理图？其主要原因是遗传图的精确性较低、分辨率有限，而物理图是对遗传图的进一步深化，并能直接应用于图位克隆技术分离目的基因。1998年，Umehara等构建了水稻第一张物理图谱，共筛选到5701个YAC，其中2117个单一YAC分配到12条染色体上，跨度216Mb，覆盖水稻基因组的50%。接着日本水稻基因组计划（RGP）开始将YAC重叠群（contig）分解成粘粒（cosmid)DNA克隆，构建更精细的物理图谱。2001年，RGP还构建了一个覆盖270Mb（全基因组的63%）的YAC文库的物理图，由6934个YAC组成，插入片段平均长度为350kb。
由于YAC克隆不太稳定、插入DNA难以分离、转化效率低等原因，美国Clemson大学基因组研究所（ClemsonUniversityGenomicsInstitute，CUGI）又建成了两个BAC库，一个是由37000个HindⅢ酶切的BAC文库，插入片段平均长度为128.5kb；另一个是有56000个克隆的EcoRⅠBAC库，插入片段平均大小为120kb，两者覆盖水稻基因组的26倍。1997年，中国科学院国家基因研究中心(NationalCenterforGeneResearch,NCGR）发表了由指纹?锚标法策略建成的含565个分子标记且覆盖率较高的水稻广陆矮4号基因组BAC库物理图。
2001年，RGP为了克服YAC克隆的局限性，又以PAC为载体构建了水稻Nipponbare基因组文库，此文库由72000个Sau3AⅠ酶切克隆组成，平均插入片段长120kb，覆盖水稻基因组的16倍。RGP也对75000个PAC克隆进行了排列，所有已定位的可用标记用于鉴定和锚定PAC克隆。这些克隆分成3个池，以EST衍生的特异引物进行PCR排序，一个EST共有的几个PAC克隆被认为是重叠的，它们归为一个克隆群，这个方法可以解除由于杂交探针属于多基因家族而带来的困难。 国际水稻基因组测序计划（IRGSP）由1997年在新加坡举行的植物分子生物学会议发起；1998年，中国、日本、美国和韩国的代表共同草拟了资源共享等组织议程；2000年在美国的C1emson召开了协调会，对12条染色体测序任务进行了分工（表1）。测序工作分为测序、填补缺口和最后完成三个阶段。对于最后测序结果的标准，IRGSP规定为误差率低于1/10000（精度99.99%）。第二阶段是测序工作的瓶颈，测序阶段留下的缺口需要补平，水稻特殊序列组成（易于形成二级结构和GC富集区）和重复序列造成的低质量测序结果需要改进。通过各研究机构和私营公司的共同努力，IRGSP已于2002年12月宣布，利用克隆连克隆（逐步克隆）测定法（clonebyclonesequencing），提前3年完成了水稻12条染色体的碱基测序工作。日本在其中发挥着主导作用，并最先以99.99%的精度完成了最长的第1条染色体的测序工作。此前，孟山都公司同意将已构建的水稻基因组序列草图（包括已构建物理图的3416个BAC和125619个STC序列）转让给IRGSP。RGP对原有的物理图进行延伸及弥补物理图上的空缺，大大加速了水稻基因组测序工作进程。中国科学家完成了第4染色体全长序列的精确测定。第1、4染色体的序列和结构已同时发表在2002年11月《Nature》第420期第312～320页。由美国Clemson大学负责的第10染色体的全长序列也已发表在2003年9月的《Science》上。其余各条染色体的测序结果也将陆续发表。另外，中国科学院基因组信息中心暨北京华大基因研究中心（简称基因信息中心）等12家单位，于1998年至2001年利用全基因组霰弹法（wholegenomeshotgunsequencing,WGS），构建了籼稻93-11基因组工作框架图和低覆盖率的培矮64S草图，并最先向全世界公布了水稻93-11全基因组框架图。随后，美国先正达（Syngenta）公司也完成了日本晴基因组工作框架图的测序。两个框架图同时发表在2002年4月的《Science》第296期第79～99页，它们都是对IRGSP的补充。

4、 忆江南 白居易

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