【求助】WB上样量应为多少？

【求助】WB上样量应为多少？

>这要根据你做的蛋白表达量多少，一般是用DAB显色要50-100μg，用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg，ecl法至少20pg。我也用组织作过western，蛋白浓度的确很高。
通常我上50-100ug，足够了。如果蛋白浓度太高导致上样过小，可用裂解液稀释蛋白使总上样体积在10ul即可，勿用水稀释会改变PH值。
上样不要过高，否则条带兜一大坨，不好看。
具体还得在试验后确定，如果内参出来，目的蛋白不出来，可能表明目的蛋白丰度低，上样量相对不足可在增加上样量试试。
当然目的蛋白不出来的原因有很多：）这只是从上样的角度考虑。好的，多谢我前几天预示了一下，倒是有条带，我我算了一下就150-160μg,请问一下各位，加这么高的量可以吗？关键是你自己分析一下你底预实验结果，最后得到清晰而不太浓密底条带最好。其实WB控制最后显示底条带不仅可以控制上样量，还可以控制WB整个过程中底许多环节，所以不要怕试，多做几次浓度剃度底预实验，比在后面老是瞎作一气好。还有具体多少量确实别人也不能帮你回答。上多少没关系，关键是能上得去，并且跑出来有条带。如果只在160ug能做出来就用160ug.

凝胶电泳是为了分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。加入缓冲溶液是为了调节合适的离子浓度和ph值，保持分离物质分子构象不变。缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的ph。电泳时正极与负极都会发生电解反应，正极发生的是氧化反应（4oh--4e->2h2o+o2)，负极发生的是还原反应（4h++4e->2h2)，长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，是溶液两极的ph保持基本不变。 电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于dna分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/l的na+离子，na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。 电泳缓冲液还有一个组分是edta，加入浓度为1-2mmol/l，目的是螯合mg2+ 等离子，防止电泳时激活 dna酶，此外还可防止mg2+离子与核酸生成沉淀。

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