如何利用核磁共振技术研究生物大分子的相互作用

如何利用核磁共振技术研究生物大分子的相互作用

NMR技术即核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。对于有机分子结构测定来说，核磁共振谱扮演了非常重要的角色，核磁共振谱与紫外光谱、红外光谱和质谱一起被有机化学家们称为“四大名谱”。目前对核磁共振谱的研究主要集中在1H和13C两类原子核的图谱。
核磁共振的特点：①共振频率决定于核外电子结构和核近邻组态；②共振峰的强弱决定于该组态在合金中所占的比例；③谱线的分辨率极高。
早期的核磁共振谱主要集中于氢谱，这是由于能够产生核磁共振信号的1H原子在自然界丰度极高，由其产生的核磁共振信号很强，容易检测。随着傅立叶变换技术的发展，核磁共振仪可以在很短的时间内同时发出不同频率的射频场，这样就可以对样品重复扫描，从而将微弱的核磁共振信号从背景噪音中区分出来，这使得人们可以收集13C核磁共振信号。
近年来，人们发展了二维核磁共振谱技术，这使得人们能够获得更多关于分子结构的信息，目前二维核磁共振谱已经可以解析分子量较小的蛋白质分子的空间结构。 核磁共振波谱技术用来研究生物大分子有如下特点：
①不破坏生物高分子结构（包括空间结构）。
②在溶液中测定符合生物体的常态，也可测定固体样品，比较晶态和溶液态的构象异同。
③不仅可用来研究构象而且可用来研究构象变化即动力学过程。
④可以提供分子中个别基团的信息，对于比较小的多肽和蛋白质已可通过二维NMR获得全部三维结构信息。
⑤可用来研究活细胞和活组织。

生物膜上含有的h、c、p等具有非零自旋的磁性核 ，当与外磁场和射频场相互作用，并且满足共振条件时，将吸收射频场能量而发生自旋能级间的跃迁，这就是核磁共振(nmr)的基本原理。由于nmr技术可以对含水样品进行非破坏性测量，从而使观测能在接近生理条件下实现，并可通过生物膜上h、c和p进行综合研究，尤其是可以从原子或基团水平上提供分子的动态结构和运动的信息，是研究生物膜结构的有力工具。 生物膜主要由蛋白质和脂质组成，结构比较复杂，而磷脂脂质体却能表现出生物膜结构的许多性质，是生物膜的理想模型。磷脂脂质体主要以凝胶相和液晶相存在，在凝胶相，分子的局部运动很慢，分子间和分子内的偶极相互作用没有被有效地平均，所以nmr谱线很宽，得到的信息非常少;而在液晶相，分子局部运动受到的限制减少，运动加快，从而使nmr谱线窄化，得到高分辨的nmr谱。 nmr技术在生物膜结构研究中应用非常广泛。用h、c和p nmr谱可以鉴定磷脂的种类。通过弛豫时间测定的方法可以研究磷脂双分子层不同部位的流动性。将磷脂分子不同位置的氢选择氘代，用h四极分裂和p化学位移各向异性的方法可以研究磷脂脂酰链的流动性、极性基团的构象以及磷脂与其它分子的相互作用(蛋白质、药物和金属离子等)，利用p化学位移各向导性方法可以研究磷脂的多形性。近年来，随着nmr技术的发展，二维(2d)和固体高分辨nmr技术也被应用于生物膜研究领域，并且已成为非常重要的手段。利用通过化学键建立的相关谱(如cosy等)可以进行多组分磷脂或磷脂与其它分子混合体系每个基团的谱线归属。而通过空间建立的相关谱(如noesy等)可以直接提供基团之间距离的信息，是研究膜脂结构以及与其它分子相互作用的有力工具。固体高分辨技术不仅可以研究液晶态的磷脂，而且可以应用于凝胶态磷脂的研究中。 对于某一种磁性核，其磁矩在磁场中可以有不同的取向。对于质子而言，可以有两种取向，即与静磁场平行和反平行，前者属于低能态，后者属于高能态。如果在垂直于静磁场的方向上加一个射频场，当射频场的频率与核的larmor频率(核磁矩绕磁场方向进动频率)相等时，处于低能态的核子便吸收射频能，跃迁到高能态。射频场去掉后，高能态的核子通过弛豫过程又回到低能态，从而就能观察到nmr的信号。弛豫过程有两种，一种是自旋—晶格弛豫，此过程用t1表示;另一种是自旋—自旋弛豫，用t2表示。t1是描述自旋体系吸收能量后将其能量转移给它周围环境而恢复到平稳态的时间，t2过程中自旋体系内部有能量的偶合，自旋体系总能量没有变化。弛豫时间与分子运动有关，通过弛豫时间的测定，可以研究生物膜各部位的流动性。 生物膜c和p化学位移各向异性与运动有很大关系。所谓化学位移各向异性，是指核所处的静磁场方向改变，核的共振频率(即化学位移)就发生变化，由于i=的核周围电子密度分布是球对称，所以如果静磁场方向改变， 核的有效感应磁场也就随之变化，处于不同形态，其运动方式不同，因而化学位移被平均的取向也不同。通过p化学位移各向异性可以研究磷脂的多形性;此外，还可以用i=1的h各向异性(四极分裂)谱研究磷脂分子空间取向的平均分布信息。 2d nmr有别于常规一维(1d)nmr的主要点在于1d nmr只涉及一个频率变量，是吸收峰强度对一个频率变量作图;而2d nmr谱则代表两个独立频率，是吸收峰强度对两个频率变量作图。一般将2d nmr实验分4个区域，即预备期、发展期(t1)、混合期(可以没有)和检测期(t2)。预备期是为了使磁化矢量达到适当的初始态而设置的，接着在发展期磁化矢量进行演化，在混合期内自旋系统发生相干转移，最后在检测期信号被检测。逐次改变t1反复循环累加，最后将所得数据进行两次傅里叶变换：即可得到2d nmr谱。2d nmr谱可分为通过化学键和空间建立起来的两类相关谱，两类2d nmr谱对谱线归属都非常重要，后者对于生物膜分子空间构象研究也非常有力。 综上所述，核磁共振分析方法在生物研究 上的应用主要有以下几个方面： 测定溶液中生物大分子的三维空间结构； 分析生物大分子在溶液状态下的分子动力学； 研究蛋白质的相互作用和酶的作用机理等； 解析固体膜蛋白和纤维蛋白的结构和运动性质； 基于蛋白质靶点的药物筛选和设计； 研究活体状态下生物分子的功能活动和生理代谢。

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