请教用溶菌酶裂解细菌的配方

请教用溶菌酶裂解细菌的配方

溶菌酶( lysozyme )主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、乳汁、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点( pH11.0 )，使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。 本实验在平板上进行唾液…

溶菌酶( lysozyme )主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白，属乙酰多糖酶。存在于唾液、乳汁、泪液和鼻及气管等分泌物中，能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点( pH11.0 )，使它能与细菌牢固结合，并水解细菌细胞壁肽聚糖，使细菌裂解死亡。
本实验在平板上进行唾液酶的测定。溶菌酶与枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis )作用后，可使该菌因细胞壁破坏而溶解，致使琼脂板加样孔周围出现溶菌环。溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数呈直线关系。
【材料】
1• 无菌 PBS ( pH6.4 ， 1/15mol/L )， 5mol/LKOH ， 3%PBS 琼脂，溶菌酶标准品，受验者唾液。
2• 枯草芽胞杆菌 12 小时培养物。
3• 10×100 试管，试管架，无菌平皿，打孔器，微量加样器。
4• 分光光度计，水浴箱，温箱等。
【方法】
1. 菌液配制：将 PBS 加入枯草芽胞杆菌斜面，置室温 5-10 分钟后制成菌悬液；在波长 640nm 处，测定菌悬液的浓度，并将菌液浓度调至透光率 30-40% 。
2. 溶菌酶标准液配制：称取溶菌酶标准品，用 PBS 配成 1000 m g/ml ，置冰箱冻存，临用时再稀释成 100 、 50 、 25 和 10 m g/ml 。
3. 收集唾液标本：待检测者用清水漱口后，将唾液收集于消毒平皿内待用。
4. 加热融化 3% 琼脂，冷至 60 -70℃ ，与预热好的枯草芽胞杆菌菌悬液等体积混合，到平板。用打孔器在平板上打孔，孔间距约 1.5cm , 每平板可打孔 8-9 个。
5. 各孔内依次加溶菌酶标准品和唾液样品，每孔 20 m l 。
6. 置于 24 -26 ℃ 12-18 小时后测量溶菌环直径。
【结果判断】
记录溶菌环的直径( mm )于下表，绘制标准曲线，并从标准曲线上查出所测样品的溶菌酶含量。

用于提取大质粒(大于15kb)的蔗糖溶液与细菌细胞内液是等渗的，这样能够避免出现因渗透压改变而导致的细胞不稳定状况出现，便于后续的溶菌酶和edta处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入sds一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或n-乙酰胞壁质聚糖水解酶（n-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。 生物酶作用最重要的就是专一性，由于溶菌酶不具有识别并水解蔗糖糖苷键的作用位点所以其不水解蔗糖。

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