脉冲场凝胶电泳的凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳的凝胶电泳

1．将0.8%的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。
2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。
3．用1%液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25×TBE配制）密封狭槽。
4．若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。
5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。
6．应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。
7．电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。
8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。
9．凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。
10． 用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA脱嘌呤，并有利于转移。
11． 凝胶用碱（变性溶液中）变性20min，两次，续以中性溶液1～5min。
12． 采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h）。

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