RNA转录为cDNA的试剂盒有哪几种，优缺点各是什么
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解决时间 2021-11-28 12:42
- 提问者网友：你挡着我发光了
- 2021-11-28 05:22
RNA转录为cDNA的试剂盒有哪几种，优缺点各是什么
最佳答案
- 五星知识达人网友：不如潦草
- 2021-11-28 06:30
说白啦，你就是要逆转录试剂盒啦。每个课题组用的都不一样，我们课题组用的比较多的是OneShine™First Strand cDNA Synthesis Kit。给你发下说明吧。
I描述
Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)是一种RNA依赖的DNA聚合酶。它可以以RNA为模板，在适当的引物引导下，通过碱基互补配对的原则，持续渗入dNTPs、形成磷酸二酯键，并最终合成出cDNA。合成出来的cDNA长度可大于5kb。M-MLV酶的RNase H活性比另外一种常用的逆转录酶Avian Myeloblastosis Virus(AMV)弱，因此更适合于反转录长链RNA。M-MLV逆转录酶的反应活性小于AMV逆转录酶，因此产生相同量的cDNA需要更多分子的M-MLV逆转录酶。
M-MLV Reverse Transcriptase的酶活性定义为在37℃将1 nmol dNTPs渗入酸可沉淀的物质所需要的酶量。反应的具体条件为50 mM Tris-HCl(pH=8.3)、7mM MgCl2、40 mM KCl、10 mM DTT、0.1 mg/ml BSA、0.5 mM [3H] dTTP、0.025mM oligo (dT)、0.25 mM poly(A)、0.01% NP-40。经检测，OneShine M-MLV酶活性为200 U/ul。
OneShine™的天然RNase Inhibitor是从人体胎盘中提取的，在不同的生物体内，该蛋白质具有序列多态性。本RNase Inhibitor的氨基末端已经被封闭，而且本产品经过HIV-1、Hepatitis A/B/C检测后均呈阴性。
RNase Inhibitor的酶活性定义为抑制5 ng核糖核酸酶A活性的50% 所需要RNase Inhibitor的量为1单位，活性测试的底物为CCMP。经检测，OneShine RNase Inhibitor酶活性为40 U/ul。
II cDNA第一链的合成步骤举例
1．在RNase-free的PCR管（OneShine RNase-free PCR管）里加入下列物质：
手指轻微弹震PCR管以混匀体系，若液体溅到盖子内壁上则短暂低速离心使其下沉入管底。70℃孵育上述体系5 min，以消除模板的二级结构，并使引物与模板能够接近；之后迅速地在冰上冷却体系，既阻止了模板二级结构的再形成，引物与模板也产生了局部的双链结构。短暂地离心PCR管，使管子上方蒸发起来的液体沉下来。
2．依次加入下列物质至经过1处理后的体系中：
手指轻微弹震PCR管以混匀体系，若液体溅到盖子内壁上则短暂低速离心使其下沉入管底。
3．把经过2处理后的PCR管放入PCR仪中，如果使用Oligo (dT)18 Primer或gene specific Primer，则设置反应程序为42℃ 60 min，若使用Random Hexamer Primer，则设置反应程序为37℃ 60 min。
4． 85℃ 5 min即可终止反应。
III注意事项
1. 试剂应储存在-20℃。
2. 合成的第一链cDNA可马上用于第二链的合成、PCR、qPCR或线性RNA的扩增，若要长期保存则建议置于-70℃以下。
3. M-MLV 5×Reaction Buffer是一种适配于后续多种实验的酶缓冲液，在进行下一步实验前不需要再用苯酚抽提和乙醇沉淀。
4. cDNA第二链合成的标准操作方法见：Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.
5. 总RNA中必须没有胍盐、多胺、亚精胺、焦磷酸盐、磷酸盐、金属离子、SDS、EDTA、乙醇和苯酚等，因为这些物质可以抑制逆转录酶的活性。
6. 总RNA必须没有DNA污染，可以对总RNA直接进行RT-PCR以验证是否有DNA的污染。也可以设置跨内含子的引物用于后续的RT-PCR实验。可以用DNaseI对总RNA做cDNA第一链合成前的处理，如OneShine DNaseI。DNaseI处理总RNA的标准操作方法见：Wiame, I. et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, Bio Techniques, 29, 252-256, 2000.
7. cDNA第一链合成实验所用的PCR管、吸头等需用DEPC水处理过，以防止RNase对总RNA的降解。
8. 在进行cDNA第一链的合成实验之前可以对所提取的总RNA进行电泳检测，电泳试剂盒和电泳槽也需用DEPC水配制或重洗,如OneShine DEPC水、OneShine RNase free电泳buffer；电泳的条带中28S和18S的边缘应清晰才表明所提的总RNA质量达到要求。
9. 可以设置不同的Control以证明是否存在影响所研究RNA的实际拷贝数的因素，比如不加模板、不加M-MLV Reverse Transcriptase的阴性Control实验，GAPDH RNA的阳性Control实验等。
10. 在进行后续的RT-PCR时，可以对cDNA第一链进行稀释。
I描述
Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)是一种RNA依赖的DNA聚合酶。它可以以RNA为模板，在适当的引物引导下，通过碱基互补配对的原则，持续渗入dNTPs、形成磷酸二酯键，并最终合成出cDNA。合成出来的cDNA长度可大于5kb。M-MLV酶的RNase H活性比另外一种常用的逆转录酶Avian Myeloblastosis Virus(AMV)弱，因此更适合于反转录长链RNA。M-MLV逆转录酶的反应活性小于AMV逆转录酶，因此产生相同量的cDNA需要更多分子的M-MLV逆转录酶。
M-MLV Reverse Transcriptase的酶活性定义为在37℃将1 nmol dNTPs渗入酸可沉淀的物质所需要的酶量。反应的具体条件为50 mM Tris-HCl(pH=8.3)、7mM MgCl2、40 mM KCl、10 mM DTT、0.1 mg/ml BSA、0.5 mM [3H] dTTP、0.025mM oligo (dT)、0.25 mM poly(A)、0.01% NP-40。经检测，OneShine M-MLV酶活性为200 U/ul。
OneShine™的天然RNase Inhibitor是从人体胎盘中提取的，在不同的生物体内，该蛋白质具有序列多态性。本RNase Inhibitor的氨基末端已经被封闭，而且本产品经过HIV-1、Hepatitis A/B/C检测后均呈阴性。
RNase Inhibitor的酶活性定义为抑制5 ng核糖核酸酶A活性的50% 所需要RNase Inhibitor的量为1单位，活性测试的底物为CCMP。经检测，OneShine RNase Inhibitor酶活性为40 U/ul。
II cDNA第一链的合成步骤举例
1．在RNase-free的PCR管（OneShine RNase-free PCR管）里加入下列物质：
手指轻微弹震PCR管以混匀体系，若液体溅到盖子内壁上则短暂低速离心使其下沉入管底。70℃孵育上述体系5 min，以消除模板的二级结构，并使引物与模板能够接近；之后迅速地在冰上冷却体系，既阻止了模板二级结构的再形成，引物与模板也产生了局部的双链结构。短暂地离心PCR管，使管子上方蒸发起来的液体沉下来。
2．依次加入下列物质至经过1处理后的体系中：
手指轻微弹震PCR管以混匀体系，若液体溅到盖子内壁上则短暂低速离心使其下沉入管底。
3．把经过2处理后的PCR管放入PCR仪中，如果使用Oligo (dT)18 Primer或gene specific Primer，则设置反应程序为42℃ 60 min，若使用Random Hexamer Primer，则设置反应程序为37℃ 60 min。
4． 85℃ 5 min即可终止反应。
III注意事项
1. 试剂应储存在-20℃。
2. 合成的第一链cDNA可马上用于第二链的合成、PCR、qPCR或线性RNA的扩增，若要长期保存则建议置于-70℃以下。
3. M-MLV 5×Reaction Buffer是一种适配于后续多种实验的酶缓冲液，在进行下一步实验前不需要再用苯酚抽提和乙醇沉淀。
4. cDNA第二链合成的标准操作方法见：Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.
5. 总RNA中必须没有胍盐、多胺、亚精胺、焦磷酸盐、磷酸盐、金属离子、SDS、EDTA、乙醇和苯酚等，因为这些物质可以抑制逆转录酶的活性。
6. 总RNA必须没有DNA污染，可以对总RNA直接进行RT-PCR以验证是否有DNA的污染。也可以设置跨内含子的引物用于后续的RT-PCR实验。可以用DNaseI对总RNA做cDNA第一链合成前的处理，如OneShine DNaseI。DNaseI处理总RNA的标准操作方法见：Wiame, I. et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, Bio Techniques, 29, 252-256, 2000.
7. cDNA第一链合成实验所用的PCR管、吸头等需用DEPC水处理过，以防止RNase对总RNA的降解。
8. 在进行cDNA第一链的合成实验之前可以对所提取的总RNA进行电泳检测，电泳试剂盒和电泳槽也需用DEPC水配制或重洗,如OneShine DEPC水、OneShine RNase free电泳buffer；电泳的条带中28S和18S的边缘应清晰才表明所提的总RNA质量达到要求。
9. 可以设置不同的Control以证明是否存在影响所研究RNA的实际拷贝数的因素，比如不加模板、不加M-MLV Reverse Transcriptase的阴性Control实验，GAPDH RNA的阳性Control实验等。
10. 在进行后续的RT-PCR时，可以对cDNA第一链进行稀释。
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