纯化的pcr产物测序需要什么样的要求
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解决时间 2021-03-25 02:27
- 提问者网友：练爱
- 2021-03-24 14:45
纯化的pcr产物测序需要什么样的要求
最佳答案
- 五星知识达人网友：愁杀梦里人
- 2021-03-24 15:03
纯化的pcr产物测序需要的要求：
(1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
(2）必须进行胶回收纯化；
(3）DNA纯度在1.6-2.0之间，浓度50ng/ul以上。
方法
(1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。
(2) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。
(3) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。
(4) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
(5) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。
(6) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。 (7) 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。 (8) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
(1)扩增产物必须特异性扩增，条带单一。如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序结果；
(2）必须进行胶回收纯化；
(3）DNA纯度在1.6-2.0之间，浓度50ng/ul以上。
方法
(1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。
(2) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。
(3) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。
(4) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
(5) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。
(6) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。 (7) 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。 (8) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
全部回答
- 1楼网友：第四晚心情
- 2021-03-24 15:35
什么测序，一代二代，如果是已经纯化好的，一代测序没什么问题的，直接测就可以了，二代的话还要建库。
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